黄芩药材一测多评质量评价方法研究

邓寒霜，李筱玲

（商洛学院生物医药与食品工程学院/商洛市秦岭植物良种繁育中心，陕西商洛 726000）

黄芩始载于《神农本草经》[1]，来源于唇形科植物黄芩（Scutellaria baicalensis Georgi）的干燥根[2]，具有泻火、解毒等功效[3-5]。黄芩中化学成分众多，仅黄酮类就有黄芩苷、黄芩素、汉黄芩苷、汉黄芩素等十余种[6-8]。我国药典中黄芩仅收录黄芩苷1种指标性成分，采用外标法（External Standard Method,ESM）作为含量测定标准。现代药理研究发现黄芩中的黄酮类化学成分均具有抑菌、抗肿瘤、抗氧化等功效[9-12]。因此，仅检测黄芩苷一种成分的含量难以全面评价黄芩药材质量。一测多评法（Quantitative Analysis of Multi-components by Single marker,QAMS）利用了在同一色谱体系中，各化学物质间相对校正因子固定不变的特性，用一种对照品实现了多种成分的含量测定[13-15]，近年来受到众多学者的关注[16-18]。本文以黄芩苷为内参物，建立了一种可同时检测黄芩药材中黄芩苷、黄芩素、汉黄芩苷、汉黄芩素等4种成分的QAMS含量测定方法，为更全面、准确地控制黄芩及其制剂的质量奠定基础。

1 材料与方法

1.1 仪器与药品

高效液相色谱仪（型号LC-20AT，购自日本岛津公司）；配置为四元泵、自动进样装置、二极管阵列检测器等；色谱柱（Diamonsil,5 μm,C18,250×4.6 mm）。黄芩苷对照品（批号：110715-201914）、黄芩素对照品（批号：111595-201906）、汉黄芩苷对照品（批号：111514-202003）均购自中国食品药品检定研究院，纯度均>98%；汉黄芩素对照品（批号：170411，纯度：>98%，购自北京世纪奥科生物技术有限公司）。

1.2 供试药材

从陕西省商洛市丹凤县、洛南县、商州区及宝鸡市扶风县、千阳县药材种植基地，收集黄芩药材样品15批；经商洛学院执业药师李筱玲鉴定为唇形科植物黄芩（Scutellaria baicalensis Georgi）的干燥根，黄芩样品来源见表1。

表1 黄芩药材样品来源

1.3 方法

1.3.1 黄芩QAMS检测方法的建立

1）色谱条件

以乙腈为流动相A，以浓度0.1%的磷酸溶液为流动相B，按表2所示进行梯度洗脱；流动相流速为1.0 mL/min；色谱柱温度为35℃；检测波长276 nm；进样量10 μL，记录55 min内色谱流出曲线图。

表2 HPLC梯度洗脱程度

2）溶液的制备

混合对照品溶液：精密称取黄芩苷对照品、黄芩素对照品、汉黄芩苷对照品、汉黄芩素对照品适量，分别以70%甲醇溶解并稀释，制成浓度约为1 mg/mL的单一对照品溶液备用。临用前取上述单一对照品溶液适量，置同一容量瓶中，用70%甲醇溶液定容，摇匀，制成每1 mL含黄芩苷 230 μg、汉黄芩苷 150 μg、黄芩素60μg、汉黄芩素150 μg的混合对照品溶液。

供试品溶液制备：取干燥黄芩药材样品适量，粉碎后过四号药典标准检验筛（65目）。精密称取样品粉末0.1 g置250 mL烧瓶中，精密吸取70%甲醇溶液50 mL加入烧瓶，称定重量。以频率为100 kHz、功率为400 W的超声波处理15 min后，取出样品烧瓶，放冷后再次称定重量，以相同溶剂补回原重，过滤，取续滤液，即得供试品溶液。

3）系统适用性考察

专属性试验：以70%甲醇为空白溶液。精密量取混合对照品溶液、供试品溶液及空白溶液各10 μL，按前述色谱条件进样，记录色谱流出曲线。

线性关系考察：精密吸取混合对照品溶液0，2，4，6，8，10 μL 进样，记录各待测组分的色谱峰面积。

精密度试验：精密吸取混合对照品溶液10 μL，连续进样6次，记录各待测组分的色谱峰面积并计算RSD。

稳定性试验：取编号为5的黄芩药材样品制备供试品溶液，分别放置 0，2，4，8，12，24 h 后精密吸取10 μL进样，记录各待测组分的色谱峰面积并计算RSD。

重复性实验：取编号为5的黄芩药材样品平行制备6份供试品溶液，分别精密吸取各供试品溶液10 μL进样，记录各待测组分的色谱峰面积并计算RSD。

加样回收率试验：取编号为5的黄芩药材样品，平行制备9份供试品溶液，分别精密加入混合对照品溶液适量后进样分析，计算各待测成分加样回收率及RSD。

4）相对校正因子与相对保留值的计算

分别精密吸取混合对照品溶液 2，4，6，8，10 μL进样分析，每个体积重复进样3次，记录各待测成分的峰面积与保留时间。以黄芩苷为内参物，分别按式(1)和式(2)计算其他待测成分的相对校正因子与相对保留值。

式中，Az为内参物峰面积，Wz为内参物浓度，Am为其他组分峰面积，Wm为其他组分浓度，tRz为内参物保留时间，tRm为其他组分保留时间[10-11]。

1.3.2 黄芩QAMS检测方法的重现性考察

在另两个不同的高效液相色谱仪上（仪器Ⅰ型号为岛津LC-10AT，配置为在线脱气机、二元高压梯度、自动进样器、紫外检测器等；仪器Ⅱ型号为安捷伦1300，配置为在线脱气机、四元低压梯度、自动进样器、二极管阵列检测器），以相同色谱条件对相对校正因子与相对保留值进行考察，各平行处理6次。

1.3.3 黄芩QAMS检测方法的准确度考察

取15批黄芩药材样品，照1.3.1的方法制备供试品溶液。分别以QAMS法和ESM法对其中的黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素含量进行测定，每批样品平行处理3次，比较两种定量方法所得结果的差异。

2 结果与分析

2.1 黄芩QAMS检测方法系统适用性考察

照1.3.1的方法，对本文研究所用色谱条件进行了系统适用性考察，如图1所示。

图1 黄芩药材高效液相色谱图

由图1可见，空白试剂对样品分析无干扰，混合对照品及供试品溶液中各成分间分离度均可达到基本分离以上，色谱条件专属性良好。

得到黄芩苷回归方程为y=25499.0861x-4711.0536（r=1.000 0），线性范围为 0～230 μg/mL；汉黄芩苷回归方程为y=17331x-4030.8（r=0.999 9），线性范围为0～150 μg/mL；黄芩素回归方程为y=11394x-9679.3（r=0.9996），线性范围为0～60 μg/mL；汉黄芩素回归方程为y=15774x-5404.8（r=0.999 9），线性范围为0～150 μg/mL，表明仪器线性关系良好。经精密度、稳定性、重复性试验考察得，黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素峰面积的RSD均<3%（n=6），表明所用仪器的精密度良好，样品溶液在24 h内稳定，本文选用检测方法具有良好的重复性。黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素加样回收率分别为102.3%，101.9%，98.1%，103.8%；各成分RSD值分别为2.11%，2.08%，1.91%，2.81%（n=9），表明本文选用检测方法具有良好的准确度。

2.2 相对校正因子与相对保留值计算结果

以黄芩苷为内参物，分别按式(1)、式(2)计算其他待测成分的相对校正因子与相对保留值，得汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素相对校正因子分别为1.02，1.66，0.93；RSD 分别为 2.03%，3.25%，1.85%（n=15）。相对保留值分别为2.11，2.80，3.57；RSD分别为 0.83%、0.96%，0.98%（n=15）。

2.3 黄芩QAMS检测方法的重现性考察结果

在不同高效液相色谱仪上对相对校正因子与相对保留值进行了考察，得各成分相对校正因子与相对保留值均与2.2中所得结果一致且RSD值均<3.5%（n=6），表明本文所得黄芩多成分QAMS检测方法在不同仪器上具有良好的重现性。

2.4 黄芩QAMS检测方法的准确度考察结果

选取15批样品，分别以QAMS法与ESM法进行检测，所得结果见表3。

表3 QAMS法与ESM法测定15批样品含量比较（n=3）

由表3可见，采用两种定量方法所得各成分含量测定结果比较接近。其中汉黄芩苷两种方法的最大误差为0.70%，黄芩素最大误差为3.33%，汉黄芩素最大误差为-2.99%。分析以上数据可以发现，后两种成分的绝对误差值很小，最大的仅为0.04，相对误差偏高是因为该成分在原药材中含量较低所致。采用SPSS 21对汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素3种成分两种定量方法所得检测结果做 t检验，得 P 值分别为 0.98，0.95，0.87，均大于0.05，表明采用QAMS法与ESM法所得检测结果无显著差异，以QAMS法作为黄芩药材的含量测定方法具有一定的可行性。

3 讨论与结论

本文以黄芩苷为内参物，建立了可同时检测黄芩药材中黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素4种成分的QAMS方法，经方法学考察并在其它实验室验证后表明，本方法具有良好的重复性、精密度、稳定性且线性关系较好。采用本方法检测了15批黄芩药材，所得结果与ESM法比较并无显著差异，结合加样回收试验结果，证明本文所得QAMS法具有良好的准确性，可用于黄芩药材的质量控制，有一定的推广应用价值。本文供试品溶液的制备方法与现行药典比较，主要区别是将加热回流提取3 h，改为超声处理15 min，同时省略了稀释步骤，使得工作效率大为提高，可节省人力资源与能源，符合绿色环保理念。课题组将多个梯度洗脱程序进行比较，最后确定的洗脱程序更为便捷，同时确保了各待测组分具有良好的分离度与柱效。

中药是多种化学成分的复合体，每一味中药的功效都是其中所有活性成分共同药理作用的综合体现。多指标、全面、客观地评价药效，是中药质量控制的目标。QAMS法可以在不增加企业检测成本的前提下实现多成分的含量控制，已成为中药多指标检测研究的主要方向之一[19-20]，我国药典中也有越来越多的样品采用了该方法。但QAMS法也存在一定的局限性，例如在测定某些含量很低的成分时误差较大等。QAMS法的改进，还需进一步完善，并尽可能在更多的品种中进行推广，以期为中药的多指标综合质量控制奠定基础。