纤维素酶生产菌的筛选鉴定及其产酶影响因素研究*

李毅然 马 亢

(商丘师范学院生命科学学院，河南 商丘 476000)

纤维素酶生产菌的筛选鉴定及其产酶影响因素研究*

李毅然 马 亢

(商丘师范学院生命科学学院，河南 商丘 476000)

通过筛选从土壤和腐朽树木中得到了4株纤维素酶高产菌株MF1、MF4、TF3和TF9，经初步鉴定分别是绿色木霉、青霉属、康氏木霉和黑曲霉。通过对TF3发酵产酶的影响因素研究表明，其发酵产酶的最佳碳源是麸皮－纤维素粉复合物，最佳氮源是硫酸铵，最适发酵温度范围是30～32℃，最适初始pH范围是6～7。

筛选;鉴定;纤维素酶;影响因素

当今，石油等不可再生能源日益消耗，自然界中大量的纤维素资源越来越受到人们的青睐。纤维素类物质自身所具备的可再生、廉价、丰富、分布广、环保等特点，及其广泛的用途，其价值不可估量［1，2］。而利用纤维素最有效的途径是通过纤维素酶类进行生物降解，该途径经济、环保、快速。纤维素酶是指能够对纤维素类物质进行降解并生成葡萄糖的一类酶的总称，是几种具有不同酶活力的酶复合物，主要包括外切纤维素酶、内切纤维素酶、β－葡萄糖苷酶等［3］。利用微生物产生的纤维素酶将纤维素转化为食品、能源和化工材料，对解决人类所面临的诸多问题具有极大的现实意义［4，5，6］。当前，阻碍人类广泛高效地利用纤维素的瓶颈，仍然是缺少纤维素酶的高产菌，因此，筛选具有高活性纤维素酶的微生物菌株仍是该领域的研究热点和难点之一。本实验在参阅大量文献和广泛采样的基础上，分离到了4株纤维素酶活性较高的菌株，并对其产酶温度和初始pH条件做了研究。

1.实验材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 样品采集

样品采自于商丘市伐木场锯末堆下土壤、森林公园腐朽树木，将样品置于实验室进行自然风干，除去杂质，粉碎，过筛，然后装入样品袋待用。所用试剂药品均为市售分析纯。

1.1.2 培养基

富集培养基: (NH4)2SO41g，KH2PO42g，MgSO4·7H2O 0.3g，CaCl20.3 g，FeSO4·7H2O 5mg，CMCNa 5g，葡萄糖2.5g，蛋白质1g，蒸馏水1000ml。

筛选培养基:CMCNa 5 g，KCl 0.5g，KH2PO40.5g，MgSO4·7H2O 0.25g，FeSO4·7H2O 5mg，NaNO33g，刚果红0.05g，蛋白胨1g，琼脂粉15g，蒸馏水1000ml。

种子培养基:纤维素粉25g/L，麸皮20g/L，(NH4)2SO41.5g/L，KH2PO42g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，pH自然。

发酵培养基:CMC 7g/L，麸皮6g/L，(NH4)2SO42g/L，蛋白胨0.6g/L，吐温 －80 1.5mL/L，KH2PO42g/L，CaCl20.3g/L，MgSO40.3g/L，Mn SO4·4 H2O 0.3 g/L，pH6。

基础培养基:CMCNa 20g，KH2PO42g，(NH4)2SO42.5g，MgSO4·7H2O 0.3g，CaCl2·2 H2O 0.3g，FeSO4·7H2O 5mg，MnSO4·4 H2O 1.5mg，ZnSO4·7H2O 2mg，CoCl2·6 H2O 1.7mg，吐温－80 1.5ml，蒸馏水1000ml，pH自然。

PDA培养基:马铃薯200g，蔗糖20g，水1000ml。

1.1.3 溶液配制

柠檬酸缓冲液:称取7.16 g Na2HPO4，溶于蒸馏水中，定容至100ml，即为0.2mol/L磷酸氢二钠溶液;称取2.1g柠檬酸，溶于蒸馏水中，定容至100ml，即为0.1mol/L柠檬酸溶液。取0.2mol/L磷酸氢二钠溶液24.3ml和柠檬酸溶液25.7ml混匀。

羧甲基纤维素钠溶液:准确称取羧甲基纤维素钠2.0g，溶于200ml蒸馏水中，沸水浴中加热至融化，过滤，取滤液150ml，加柠檬酸缓冲液30ml，蒸馏水60ml，混匀，置于冰箱中备用。

3，5—二硝基水杨酸显色液［7］:按照文献中提供的方法配制，贮存于棕色瓶中放置于冰箱中备用。

标准葡萄糖溶液配制:准确称取已烘干的葡萄糖200.00mg，溶于蒸馏水中，定容至200.00ml。

1.2 试验方法

1.2.1 菌种分离筛

取处理好的样品10g放入装有100mL无菌水和无菌玻璃珠的三角瓶中，振荡10min后吸取上清液，将上清液接入富集培养基中进行富集培养;取富集培养液，按梯度稀释到10－2，10－3，10－4，10－5，10－6，分别涂布到筛选平板培养基上，28℃培养 3 ～6d，挑取具有明显水解圈的菌落进行纯化，并将纯化后的菌株用斜面保存于4℃冰箱中;将保存的纯化菌株制备成种子培养液，按照10%接种量接入到发酵培养基中进行发酵培养，根据各菌株酶活性高低进行复筛，并将复筛得到的菌株进行保存。

菌株静定:将筛选出的菌株用平板进行纯培养，根据其菌落、菌丝、孢子形态及其生长特性，依据《真菌鉴定手册》、《中国真菌志》、《菌物学概论》和《微生物学教程》等进行分类鉴定。

1.2.2 CMCase和FPAase酶活测定

CMCase 和 FPAase 酶活测定参考赵玉萍［7］高培基［8］和张瑞萍［9］所提供的方法。

1.2.3 菌株产纤维素酶的影响因素研究

(1)不同碳、氮源培养基对产酶的影响

实验分别以稻草粉、麸皮、纤维素粉 (MCC)3种物质及其复合物为碳源替换基础培养基中的CMCNa，不同碳源添加量均为20g/L，分别将不同碳源培养基装入250mL锥形瓶中，按照5%接种比例接入菌种子液，在28℃下，160r/min震荡培养120h，然后测定不同碳源的产酶量。

在基础培养基中，分别添加2.5g/L的硫酸铵、氯化铵、碳酸按、硝酸铵、硝酸钾、蛋白胨、牛肉膏、黄豆饼粉为氮源，其他物质元素不变，培养条件同上。培养后测定不同氮源的产酶量。

(2)温度对产酶的影响

发酵液培养基成份和其他培养条件同1.2.3.1，分别在25、28、30、32、35、38℃下发酵培养120h，测定不同培养温度的产酶量。

(3)初始pH对产酶的影响

发酵液培养基成份和其他培养条件同1.2.3.1，分别将培养基初始pH调至3、4、5、6、7、8，振荡培养120h，测定不同初始pH的产酶量。

2.实验结果与分析

2.1 筛选菌株的纤维素酶产量

将初筛得到的9株真菌，按照5%接种比例接入基础培养基，依据1.2.3.1中的培养条件，震荡发酵培养120h后，测定各菌发酵液产酶量，得到产酶量较高的菌株有4株，该4株菌的产酶活性测定结果如表1所示。从表表1可以看出，复筛得到的4株菌，其中CMCase活性较高的是TF3，达到241.3IU/mL，FPAase活性较高的是TF9，达到7.8IU/mL。

表1 菌株发酵液的纤维素酶(CMCase和FPAase)活力Tab.1 The CMCase and FPAase activities of strains in fermentation broth

2.2 目的菌种形态学分析和鉴定

通过富集培养和平板筛选，分别从伐木场锯末堆土壤和森林公园腐朽树木中，初步筛选出9株具有较大透明圈的真菌。分别是MF1、MF4、TF3、TF9，其中MF1、MF4源于腐朽树木，TF3、TF9源于锯末堆土。

在PDA平板上培养MF1、MF4、TF3、TF9，并观察各菌落生长特征。其中MF1菌落初步形成白色绒毛状，圆形，致密，随着培养时间延长中部变为绿色，而后成为深绿色，随生长期进一步延长，菌落出现轮状浓密的菌丝并产生大量孢子。菌落背面现灰色。孢子梗分枝少，呈次级单分枝并有弯曲。分生孢子较大呈球状。通过比对，与绿色木霉的生长特征最相似，初步鉴定为木霉属，绿色木霉。MF4菌落初期呈现白色絮状，而后变成灰绿色，菌落逐渐变厚，表面呈毛毯状，外圈白色毛状并向四周延伸。通过镜检，菌丝为白色有隔，分生孢子梗呈扇形辐射状。初步鉴定为青霉属。TF3菌落生长初期为白色绒毛状，呈圆形，致密，而后菌落中部变成绿色，菌落出现轮状有白色菌丝，最后菌落变成黄绿色，菌落背面现微黄色。孢子梗束状，有三级分枝，分生孢子呈椭圆状。初步鉴定为木霉属，康氏木霉。TF9菌落生长初为白色，而后呈黑褐色厚绒毛状，背面略呈黄色。分生孢子梗丛生，长短不同，分生孢子球状，黑褐色。初步鉴定为黑曲霉。

2.3 菌株TF3的发酵产酶影响因素分析

为进一步考察所分离菌株的产酶能力，实验以TF3为研究对象，对菌株的主要发酵条件进行了研究分析。

2.3.1 碳源、氮源对纤维素酶活性的影响

不同碳源对TF3产酶的影响实验结果见表2，从实验结果来看，不同碳源对产酶具有较明显的影响。当发酵液加麸皮和纤维素处理后，菌株的产酶活性量最高，CMCase活性达到278.1 IU/mL，FPAase活性达到8.9 IU/mL。因此，TF3菌株发酵产纤维素酶的合适碳源为麸皮和纤维素粉的复合物。因为麸皮中含有丰富的微量元素，有利于菌体生长，同时纤维素粉对纤维素酶生产具有较强的诱导作用。当仅用稻草粉处理时，纤维素酶活性最低，其中CMCase活性只有117.2 IU/mL，CMCase活性仅为4.1 IU/mL。可见，麸皮纤维素粉复合物与稻草粉之间差异最为显著。添加稻草粉的CMCase活性和CMCase活性平均值分别是160.1 IU/mL和5.5 IU/mL，添加麸皮的CMCase活性和CMCase活性平均值分别是215.8 IU/mL和7.4 IU/mL，添加纤维素粉的CMCase活性和CMCase活性平均值分别是236.6 IU/mL和6.8 IU/mL。从以上数据来看，发酵液中添加纤维素粉有利于CMCase量的提高，添加麸皮有利于FPAase量的提高。

表2 不同碳源对TF3产酶的影响Table 1 Effect of different carbon sources on the cellulase production of TF3

不同氮源对TF3产酶的影响实验结果见表3，从实验结果来看，不同氮源对产酶也具有较大影响。从产酶活性大小可以得出，硫酸铵提供氮源时，产酶活性最高，黄豆饼粉作为氮源时，其产酶活性最低，可见发酵产酶的最适氮源为硫酸铵，其次是氯化铵。总之，铵态氮产酶效果好于硝态氮，无机氮产酶效果好于有机氮。

表3 不同氮源对TF3产酶的影响Table 1 Effect of different nitrogen sources on celluase activity

2.3.2 温度对产酶的影响

实验研究测定了TF3在设定的梯度温度下的产酶能力，实验结果见图1。从图示可以看出，温度对TF3产酶能力有明显影响，当发酵温度为32℃时，CMCase活性最高达到261.7 IU/mL;当发酵温度为30℃时，FPAase活性最高，达到7.3 IU/mL。当发酵温度过低或过高时，CMCase和FPAase活性都显著降低，因为发酵液温度过低时，不利于微生物的快速生长，蛋白质合成受到抑制，从而影响产酶量;相反，当发酵液温度过高时，加快了酶蛋白的变性速度，从而使酶活性丧失。可见，TF3发酵产酶的适宜温度在30～32℃范围内。

图1 发酵温度对产纤维素酶的影响Fig.1 Effect of incubating temperature on the cellulase production

2.3.3 初始pH对产酶的影响

实验研究测定了TF3在不同初始pH发酵产酶能力，实验结果见图2。从图示可以看出，发酵液初始pH对产酶量具有明显影响，当发酵液初始pH为6时，CMCase活性最高，达到248.3 IU/mL;当发酵液初始pH为7时，FPAase酶活达到最高值7.5 IU/mL。可见，TF3发酵产纤维素酶的最适初始pH范围大致在6～7之间。

图2 初始pH对产纤维素酶的影响Fig.1 Effect of initial pH on the cellulase production

3.结论

通过初筛和复筛，分别从伐木场锯末堆下土壤和森林公园腐木中筛选得到了4株产纤维素酶活性较高的菌株，经初步鉴定，本别是绿色木霉－MF1、青霉属－MF4、康氏木霉－TF3、黑曲霉－TF9，详见表1。通过研究考察了碳源、氮源、温度和初始pH对TF3产酶的影响，结果显示，TF3发酵产纤维素酶的最佳碳源为麸皮纤维素复合物，最佳氮源为硫酸铵，最适发酵温度范围是30～32℃，发酵液最适初始pH范围是6～7。

实验仅从温度和初始pH两个方面研究了它们对TF3产酶的影响，要进一步该株菌的产酶潜力大小，还需要对更多的因素及其各因素之间的相互作用进行研究。本实验成功筛选出了4株菌，为后续的应用研究奠定了良好的基础。

［1］王海波，秦元萍，余康.我国农作物秸秆资源的分布、利用与开发策略 ［J］.国土与自然资源研究，2008(2):92—93.

［2］夏黎明.可再生纤维素资源酶法降解的研究进展 ［J］.林产化工通讯，1999，33(1):23—28.

［3］罗贵民，曹淑桂，张今.酶工程［M］.北京:化学工业出版社，2002:371—372.

［4］刘晓晶，李田，翟增强.纤维素酶的研究现状及应用前景 ［J］.安徽农业科学，2011，39(4):1920—1921.

［5］宋京城，蔡健.纤维素酶在食品工业中的应用 ［J］.农产品加工，2010，(3):69—71.

［6］夏友国，黄勤楼等.纤维素酶及其在畜牧业中的研究与应用进展［J］.家畜生态学报，2010，31(3):5—9.

［7］赵玉萍，杨娟.四种纤维素酶酶活测定方法的比较 ［J］.食品研究与开发，2006，27(3):116—118.

［8］高培基.纤维素酶滤纸酶活测定方法的改进 ［J］.植物学理学通讯，1986，14(2):46—48.

［9］张瑞萍.纤维素酶的滤纸酶活和CMC酶活的测定 ［J］.印染助剂，2002，3(10):51—53.

Isolation and identification of cellulase－producing fungus and the effects on the cellulase production

LI Yi－ran;MA Kang
(Department of Life Science，Shangqiu Normal University，Shangqiu 476000，China)

Four cellulase－ producing fungus were screened from soil and rotten wood sample．They were identified as T．viride persex－MF4，Penillium －MF4，Trichoderma koningii－TF3，Aspergillus niger－TF9．The influence factors on the cellulase－producing by the TF3 were studied．The results indicated that the optimum conditions of producing cellulase were as follows:carbon source was bran and micro－cellulose complex，nitrogen source was ammonium sulfate，culture temperature was 30－32℃，initial pH was 6—7．

Screen;identification;cellulase;influence factors

Q939.9

A

1671－7406(2011)09－0075－06

2011－05－11

李毅然 (1980—)，男，河南商丘人，商丘师范学院，硕士，助教。研究方向:环境微生物。

(责任编辑 徐成东)