惠阳胡须鸡禽白血病病毒多样性PCR-HRM技术检测方法的建立与应用

陈 圆，陈岸妃，李红伟，张春红，郭鹏举

（1.惠州学院 生命科学学院，广东 惠州 516007；2.广东省农业科学院动物卫生研究所，广东广州 510640；3.广东省实验动物监测所 广东省实验动物重点实验室，广东 广州 510000）

惠阳胡须鸡，广东省三大名鸡之一，是我国优良的地方鸡种［1-2］．近年来随着禽白血病病毒的入侵，当地禽养殖业受到的危害日趋严重．禽白血病是由禽白血病病毒感染鸡禽体内而引发的的各种可传染的良性或者恶性肿瘤疾病的统称［3］，该病毒可通过感染鸡禽类的血浆、泄殖腔、蛋清、精液等进行传播［4］．根据禽白血病病毒（ALV）的囊膜蛋白的抗原性、交叉免疫反应等多种特性，将禽白血病病毒分为A、B、C、D、E、K、J共7个亚群［5-9］．目前，检测禽白血病常用的方法为ALV p27抗原的ELISA方法，虽然ELISA检测灵敏快速，但无法区分内源性禽白血病病毒［10-11］；gp85基因体外扩增（PCR）诊断技术，通过ALV囊膜gp85基因两端的一段序列分别设计引物进行检测，虽然灵敏度较高，但假阳性也高．显然，这些方法均有一定的缺陷，无法对禽白血病病毒进行快速、准确的分析［12-14］．

PCR—高分辨熔解曲线分析技术（PCR-high resolution melting curve analysis，PCR-HRM）是将RT-PCR与HRM分析技术两者联合起来．RT-PCR技术在分析基因的转录水平、获取目的基因、合成cDNA探针等方面有着广泛的运用，使RNA检测的灵敏性大大提高，使一些极为微量RNA样品分析成为可能，该方法成为早期诊断禽白血病较稳定、快速、灵敏的方法［15-17］．HRM是近年来兴起的单核苷酸多态性（SNP）和基因分型快速检测新方法，通过实时监控升温过程中双链DNA荧光染料与PCR扩增产物的结合情况，在基因分型、甲基化研究等方面发挥着重要作用［18-20］．

本研究拟采用PCR-HRM技术，根据ALV A、B、E、K和J亚群禽白血病病毒囊膜糖蛋白gp85基因序列分别设计出一对A、B、E、K亚型通用引物和一对J亚型特异引物，从而对ALV不同亚型病毒进行分类与鉴定，以此建立一种区分禽白血病病毒内源型和外源型的PCR-HRM快速灵敏诊断方法．

1 材料与方法

1.1 样本来源

随机采集400例惠阳胡须鸡外周血2 mL，乙二胺四乙酸二钾抗凝保存于-80℃冰箱备用．

1.2 试剂

血液RNA提取试剂盒、PCR Mix购自天根科技（北京）有限公司．

1.3 引物设计与合成

由于ALV的不同亚型是根据ALV gp85基因序列同源性进行分型，因此根据NCBI上ALV的gp85基因设计了一对只扩增J亚型的特异性引物，上游引物P1：5’-CAGGAAACGTGTGGGTCACC-3’；下游引物P2：5’-TTATTGGACTTACCATCG-3’．还设计了一对可以同时区分A、B、E、K亚型的通用引物，上游引物P3：5’-CCTTGCTGCCAACGACACTTA-3’；下游引物P4：5’-GAACCTARCAGYTGTAGTC-3’．

1.4 RT-PCR扩增和HRM分析

提取的RNA/DNA为目标模板，用J-亚型特异引物和A、B、E、K通用引物分别进行一步法RT-PCR扩增．参照PrimeScript® One Step RT-PCR Kit（TAKARA）产品说明书，按以下组成配制RT-PCR反应液．

表1 RT-PCR反应体系

将反应体系混匀，置于Rotor-Gene QTM仪，RTPCR和HRM运行程序如下：50℃反转录30 min，94℃预变性5 min；94℃变性30 s，55℃退火45 s，72℃延伸30 s，35个循环；终延伸72℃8 min．HRM升温步骤为75℃至90℃，升温速率为0.3℃/step．RT-PCR扩增结果用Rotor-Gene QTM软件进行分析.

2 结果分析

2.1 PCR-HRM结果分析

图1显示RT-PCR完成后进行凝胶电泳分析，A1、B1、E1、J1代表禽白血病不同亚型，确认目的条带外无其它杂带；图2显示对原始熔解曲线数据进行标准化处理降低PCR产物浓度差异对HRM分型结果的影响；图3显示对不同亚型的病毒标准化熔解曲线进行导数化处理，由此可知禽白血病不同亚型的溶解曲线所代表的峰型存在差异，增强HRM辨别能力；图4显示利用HRM形状和Tm值差异均接近时显示差异化熔解曲线表示不同禽白血病病毒亚型．

图1 禽白血病4个亚型电泳图

图2 禽白血病4个亚型标准化HRM图

图3 禽白血病4个亚型峰型化HRM图

图4 禽白血病4个亚型差异化HRM图

2.2 对惠阳胡须鸡禽白血病检测结果

本次实验对惠州市不同地区惠阳胡须鸡随机采集400个血液样品，其中包括56只种公鸡、144只商品代小母鸡和200只种母鸡检测样品．通过PCR-高分辨熔解曲线分析400只惠阳胡须鸡禽白血病感染情况．其检测结果如表2．

表2 惠阳胡须鸡禽白血病不同病毒亚型感染情况分析

惠阳胡须鸡禽白血病无感染A、B亚型的白血病，表示A、B亚型的白血病已得到很好净化．但E亚型禽白血病患病率极高，并存在J、E同时感染的情况，E亚型白血病属于内源性病毒，并且它导致鸡患肿瘤的可能性很低，危害较小，但在某些情况也会影响鸡群生长发育，导致食欲降低等多种不良症状．J亚型禽白血病病毒感染率高，且有潜在致病性，可能会造成群体内水平传播，或者垂直传播影响后代的隐患，因此要加大J亚型禽白血病的防控和净化．

3 讨论和结论

据王广龙等［21］和曹伟胜等［22］对禽白血病的相关研究，其中介绍了多种禽白血病检测方法，如病毒的分离与鉴定、ALV p27抗原的ELISA方法［23-25］和ALV 27相关病毒PCR检测技术［26-27］．目前，检测ALV的传统诊断方法是ALV p27抗原的ELISA检测，国内外ELISA诊断试剂盒已基本实现商品化．该方法需要采集不同日龄的鸡血浆并接种到培养细胞来检测p27抗原，病毒的分离与鉴定结果为阳性就淘汰，其检测过程灵敏快速，但易受内源性禽白血病毒干扰而产生假阳性反应无法鉴别是否属于内源性禽白血病病毒．而ALV病毒PCR检测技术可从少量的DNA样品中检测出ALV，具有较高的灵敏度，但该PCR技术在个别情况下会出现假阳性扩增，且当禽白血病病毒发生变异时则无法检测．总之，以上方法均存在一定的缺陷，尤其对内源型禽白血病病毒检测时，需要细胞培养才能完成检测，延长了检测时间，影响禽白血病的快速检测及净化．

ALV病毒PCR-HRM检测方法，根据目标ALV A、B、E、K和J亚群禽白血病病毒囊膜糖蛋白gp85基因DNA序列的长度、GC碱基对的含量及碱基之间的互补性差异，利用高分辨率的熔解曲线对样品的基因型进行判定，用于高通量的gp85基因突变扫描进行基因分型．

本方法包括RT-PCR和HRM两个部分．RTPCR即逆转录-聚合酶链式反应，提取惠阳胡须鸡血液的mRNA作为模板，逆转录成cDNA，进行PCR扩增，从而获得gp85基因DNA序列目的基因进行检测基因表达检测．用于HRM分析的染料有必须满足两个条件：第一是染料必须是饱和，以使所有的双链DNA的小沟位置都能与染料结合，这样双链DNA在升温解链时，饱和染料就能从双链DNA上脱落，此时荧光信号就会减弱，这样就能准确反应出样品熔解温度（Tm）；第二，HRM分析所用的染料对PCR反应无抑制作用．

ALV病毒PCR-HRM检测方法相对于传统ALV检测，其优势在于：操作简单，在进行PCR反应之前加入荧光饱和染料即可；检测速率高，每5～10分钟完成96/384孔板的PCR产物检测，不需要进行病毒的细胞培养，因此极大程度的缩短了检测时间；准确性高达95%、特异性高达99%，重复性达到100%；检测分析的费用较低，每个样品所需要的荧光染料成本为1.6 RMB；本方法能较快鉴别ALV内源和外源性病毒，更重要的是能对病毒序列变化进行长期动态监测．