固氮菌肥在几种蔬菜上的肥效试验

毛露甜，谢山麟玉，黄 雁，宋冠华，陈勇智，李 盼

（惠州学院 生命科学系，广东 惠州 516000）

目前国内肥料应用方面存在问题，表现为肥料使用结构不合理，重化肥，轻有机肥和微生物肥料。尤其是长期不合理大量使用化肥导致诸如土壤肥力下降甚至退化以及作物抗病能力下降等问题［1］。化肥的使用量最大是氮肥，由于施用技术粗放，甚少配方施肥，产能过剩达40%，导致农产品硝酸盐含量过高，不符合发展生态农业的要求，也无法实现有机种植［2，3］。

虽然国家提倡多使用有机肥，一定程度上缓解了土壤污染问题和农作物品质问题，但有机肥不能改善土壤环境。在此背景下研发既能提高土壤肥力又能修复土壤生态系统的微生物肥料显得尤为必要，符合绿色种植的时代需求［4］。

微生物肥料又称菌肥，由功能菌与一定载体混合而制成，利用微生物自身的生命活动产生促进作物生长的物质，或将土壤中难溶的矿物质转化为作物可以利用的物质，从而增加肥效，或诱导作物抗病相关酶的活性，提高作物抗病力［5］。按作用机理分，微生物肥料包括固氮菌肥（如自生固氮菌和联合固氮菌等），分解难溶矿物质菌肥（如解钾菌和解磷菌），生防菌肥（如枯草芽孢杆菌）等。其中固氮菌肥是最清洁、最经济的氮肥，不仅能降低环境污染，还能修复土壤生态环境，是发展可持续生态农业种植的需要。

微生物肥料多以鸡粪等经腐熟的有机肥为载体，实现了将农家肥转化为微生物肥料，降低了环境污染，或用甘蔗渣、椰子皮堆沤处理作载体，变废为宝，都值得提倡［6］。惠州有多家规模化生产食用菌的工厂，其下脚料菌糠多被当作废物丢弃，既浪费资源又污染环境，如何合理利用菌糠变废为宝成了一个重要的研究课题［7］。

本课题筛选高效固氮菌，用栽培金针菇的下脚料——菌糠为载体，接种固氮菌制备固氮菌肥，以菠菜、小白菜和空心菜为材料，从发芽率、株高、叶绿素含量、Vc含量等指标探讨固氮菌肥的肥效，以期为蔬菜绿色种植开发一种高效稳定价廉的微生物肥料。

1 材料与方法

1.1 实验材料

菌株固氮芽孢菌（Azotobacter vinelandii），由本实验室分离鉴定并保种。

菌糠由惠州富力达农业科技公司提供。

试验用地惠州学院3号楼旁的空地，翻土三次改良成菜地。

培养基及试剂：①LB 培养基；②Ashby 无氮培养基：甘露醇10.0 g、CaCO35.0 g、KH2PO40.2 g、MgSO4.7H2O 0.2 g、NaCl 0.2 g、CaSO4.2H2O 0.2g；（固体）琼脂15.0 g；蒸馏水1000 mL。上述培养基均用1 mol/l NaOH 和1 mol/l HCl调节pH至7.0-7.2，液体培养基不加琼脂，121℃灭菌30 min后备用。其他试剂均为分析纯。

1.2 方法

1.2.1 载体的处理与微生物肥料制作

菌糠的处理 自然风干，粉碎，经紫外灯照射1 h。放置在干燥处保存备用。

固氮菌肥的制作 用Ashby 无氮培养基对固氮菌进行分离纯化，扩大培养采用LB 液体培养基。在恒温摇床28℃150r/min振荡培养到对数期，菌悬液在600 nm波长下测定OD 值（OD值＞0.5可认为活菌数＞108cfu/ml），按菌液：菌糠：无菌水为1:10:10的比例进行混匀，加薄膜覆盖，扎若干透气孔，约28 ℃堆肥4d使肥料腐熟，制备好的菌肥避光常温保存于阴凉处。

1.2.2 方法

（1）固氮菌肥各项指标检测

有效活菌数和杂菌率的测定按照复合微生物肥料（NY/T798 2004）中5.3.2的规定进行［8］。除样品有效菌外，其他菌均为杂菌（包括霉菌）。杂菌率=杂菌数/（杂菌数+有效活菌数）×100%。

（2）固氮菌肥肥效测试

发芽率的测定

将菌肥与无菌水按照1∶10的比例混合，200 r/min振荡浸提1 h，静置澄清后，将浸提液稀释制成不同体积分数（浸提液体积/稀释后体积），分别为100%、75%、50%和25%。将小白菜种子置于培养皿中，每份25粒，加入不同浓度的浸提液8mL。以无菌水为对照，每皿2个重复，于20 ℃暗培养进行发芽试验。分别在第3 d、4 d、5 d、6 d、7 d计数发芽种子数，计算发芽率。种子发芽率=发芽的种子数/供检测的种子数*100%。

蔬菜生长指标测量

取菠菜和空心菜为材料，肥效试验分3个处理组：施固氮菌肥、施菌糠和空白对照，施肥方式选用沟施，即在植株间挖沟添肥再覆土，施用量约为500 g。相同条件浇水。每个处理组种植蔬菜50株，随机选取10株分别测定株高、叶绿素含量和Vc含量。

株高：从定植起每隔5d测量一次，每块地选取10株测量取平均值即为株高。

叶绿素含量测定：取鲜绿叶片用双蒸水洗净吸干，去除叶脉，随机取样，准确称取0.50g放入研钵中，加入丙酮5 mL，少许CaCO3和石英砂，研磨成均质。用丙酮重复洗两次研钵合并过滤，用丙酮定容滤液至20mL。以分光光度计分别测定663 nm、645 nm波长处吸光值，以丙酮做对照。计算叶绿素a、叶绿素b的含量和叶绿素总含量。

维生素C含量测定：参照文献用2，6-二氯靛酚滴定法［9］，略有改动。准确配制1 mg/ml抗坏血酸标准溶液，标定2，6-二氯酚靛酚溶液至桃红色且15s内不褪色即为终点。

称取新鲜菜叶5.0 g，放入研钵中加少许2%草酸研磨至匀质，过滤成样品液。用标定过的2，6-二氯靛酚染液滴定至桃红色且15s不褪色为止，记下染液用量，重复3次，并以2%草酸做空白滴定对照。按公式计算维生素C含量。

2 结果与分析

2.1 固氮菌肥各项指标检测结果

根据中国农业部颁布的复合微生物肥料（NY/T 798-2004）标准，颗粒微生物肥料需要符合以下技术要求，有效活菌数≥0.20亿/g，杂菌率≤30.0%，水分≤20.0%，pH值5.0-8.0。菌肥指标测量结果见表1。可知固氮菌肥在有效活菌数、杂菌率和pH值上都符合要求，水分含量21.3%，与标准水分20%相差不大，可认为本实验制备的固氮菌肥基本符合微生物肥料的技术要求。

表1 自制固氮菌肥与复合微生物肥料（NY/T 798-2004）的符合度

2.2 固氮菌肥对小白菜种子发芽率的影响

种子发芽率可有效地评价肥料浸提液对植物生长有促进作用还是毒害作用。用小白菜的种子进行了发芽试验，由表2可见，浸提液浓度为25%时发芽率高于空白对照组，显示低浓度浸提液对种子发芽有促进作用。而较高浓度（75%、100%）时发芽率低于空白对照组，提示浸提液对种子有毒副作用。浓度为50%时发芽率与对照组差别不大，可能是促生作用与毒害作用相抵消的缘故。

表2 固氮菌肥不同浓度浸提液对小白菜种子发芽率的影响（n=25）

2.3 固氮菌肥对蔬菜生长的影响

2.3.1 固氮菌肥对菠菜和空心菜株高的影响

对菠菜和空心菜的株高测量结果分别见图1和图2。图1可见前10 d 3个处理组的菠菜株高差异不大，第15 d开始3个处理组的株高差异逐渐增大，施肥后第30 d差异明显，菌肥组的株高比菌糠组和对照组分别平均提高了16.1%和49.3%，且P≤0.05，差异达显著水平。图2可见前15 d 3个处理组的空心菜株高差异不大，第20d开始3个处理组的株高差异逐渐增大，施肥后第30 d差异明显，菌肥组的株高比菌糠组和对照组分别平均提高了31.2%和49.4%，且P≤0.05，组间差异达显著水平。

图1 不同处理对菠菜株高的影响（n=10）

图2 不同处理对空心菜株高的影响（n=10）

2.3.2 固氮菌肥对菠菜和空心菜的叶绿素含量的影响

叶绿素是植物进行光合作用的主要色素，是反映叶片生理活性变化的重要指标之一。由表3、4可知，施用固氮菌肥后菠菜和空心菜叶片叶绿素含量比菌糠组和对照组高，其中菌肥组的菠菜叶片叶绿素总含量比菌糠组和对照组分别提高了28.3%和34.5%，菌肥组的空心菜叶片叶绿素总含量比菌糠组和对照组分别提高了31.9%和45.7%。

表3 不同处理对菠菜叶绿素含量的影响（n=10）

表4 不同处理对空心菜叶绿素含量的影响（n=10）

2.3.3 施用固氮菌肥对菠菜和空心菜Vc含量的影响

3种处理对菠菜和空心菜Vc含量的测定结果见表5。可见菌肥组菠菜Vc含量远高于菌糠组和对照组，分别为22.8%和38.2%。菌肥组空心菜的Vc含量亦远高于菌糠组和对照组，分别为15.3%和35.9%。

表5 不同处理对菠菜和空心菜的Vc含量的影响（n=10）

3 讨论

固氮菌肥的施用对作物的反应表现在生理、产量、品质、表观形态等诸多方面。因而，不能采用单一指标来评价，只有通过对多项指标的综合评价，才能客观地反映出固氮菌肥对作物的施用效果［10］。本试验选用反映蔬菜生长发育的株高、叶绿素含量指标，以及反映蔬菜品质的Vc含量等多个指标，以期综合评定固氮菌肥对蔬菜种植的肥效。

从结果看，固氮菌肥的施用促进了蔬菜的生长发育，使菠菜的株高、叶绿素含量和Vc含量等指标显著增加。本试验主要做了固氮菌肥对菠菜和空心菜的肥效试验，至于固氮菌肥对其它蔬菜的效果以及在生产实践中的应用，还需要通过大田试验进一步验证。又由于在不同氮水平下固氮菌肥对作物的肥效存在差异，下一步可以探讨固氮菌肥的有效土壤氮素范围，以实现优化配比施肥和有效施肥。

本研究制作的固氮菌肥符合复合微生物肥标准NY/T 798-2004。固氮菌肥无论是保存期内的有效活菌数还是对蔬菜的促生效果都较明显，为农业生产提供了良好的肥料，符合生态农业的发展趋势，具有广阔的发展前景。

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