毕赤酵母直接基因敲除方法的研究

李莉玲

（广东惠州卫生职业技术学院 药学系，广东 惠州 516005）

巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）是19世纪80年代初期发展起来的一种新型的外源蛋白表达系统，在生物表达系统中研究最为广泛。巴斯德毕赤酵母具有易于高密度发酵、培养基成本低、外源基因整合稳定、外源蛋白以分泌蛋白形式存在、内生蛋白较少，以及蛋白翻译后真核加工等优点。该系统相较其他表达系统而言，弥补了大肠杆菌表达系统不易表达复杂蛋白的限制以及植物、动物细胞表达系统周期长、操作繁琐、成本高的缺点，完善了酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）分泌效率低、表达菌株不够稳定、表达质粒易丢失等缺陷，迅速成为各国科学工作者的研究热点。

但是人们也发现了巴斯德毕赤酵母外源表达系统的不足。在表达外源蛋白时，巴斯德毕赤酵母重组菌往往存在比较严重的蛋白降解现象。酵母表达外源糖蛋白时会对蛋白进行过度N-糖基化修饰，产生高甘露糖型糖链，影响蛋白的活性，从而限制了巴斯德毕赤酵母表达人源型蛋白表达在医药方面的应用。随着2009年巴斯德毕赤酵母全基因组测序和注释工作的完成，人们对影响其转录调控、表达调控及翻译后修饰等机理有了进一步的了解，可以通过相关基因的敲除达到影响表达蛋白途径，从而实现改良的毕赤酵母重组菌的构建。

巴斯德毕赤酵母中常用的直接基因缺失的方法主要分为两类：有标记的插入替换方法和无标记的Pop-In/Pop-Out方法［1］。

1 有标记的插入替换方法

有标记的插入替换方法以抗性基因作为筛选标记，在抗性基因片段两边通过PCR 扩增接上被敲除基因在宿主基因两边的同源片段。将两端连有同源片段的抗性基因通过双酶切后连入载体质粒。以该重组质粒为模板得到两端连有同源片段的抗性基因重组片段，整合到宿主菌体内，发生同源重组，导致插入的抗性基因替换掉宿主染色体上的目的基因，从而实现目的基因的敲除。

图1 基因直接插入替换原理图[1]

华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室的倪振华等人采用sh ble抗性基因作为筛选标记，采用插入替换的方法构建Polycomb Repressive Complex 1（PRC1）基因缺失菌株。方法原理见图1。其中图中的右斜线代表基因的5’序列，左斜线代表PRC1基因的3’序列。

最后将电转化后的菌液涂布在Zeocin（博来霉素）抗性平板上，30℃培养两到三天，挑选转化子进行不同部位引物的PCR鉴定，最后证实PRC1基因缺失。

图2 PCR鉴定原理图[1]

2 无标记的Pop-In/Pop-Out方法

2001年Soderholm 构建了一个通过Pop-In/Pop-Out 实现巴斯德毕赤酵母基因取代的载体pPOP（5544bp）［2］。该载体含有一个T-urf13标记基因以及与腺嘌呤生产有关的ARG4基因。把目的基因接入多克隆位点，然后转入宿主菌体内，发生两次同源重组，实现了目的基因到宿主菌基因组的无标记性整合。为基因的无标记敲除提供了思路和方法。

第一个是使用尿嘧啶生物合成基因，如URA3和URA5作为反向筛选标记，同时利用表达野生型的尿嘧啶生物合成基因的细胞不能在含有5-氟乳清酸存在下生长而进行筛选。第二个方法，同样基于反向筛选标记，引入来自T-urf13雄性不育玉米的线粒体基因组作为反向筛选标记，当灭多虫存在的时候反向筛选。另一个是Cre-loxP重组系统，两个loxP位点（loxP71、loxP66）连在标志基因的两侧，在Cre重组酶的表达下，两个loxP位点有效地重组变成单个loxP，从而导致标记基因被删除。这三种方法各有自己的优点和缺点，已成为巴斯德毕赤酵母两步基因重组敲除基因的常用的方法。

2.1 URA3作为反向筛选标记

URA5可作为反向筛选标记，而且已经被用于构建一系列整合载体，实现毕赤酵母的基因稳定改造［3］。

URA3作为反向筛选标记的Pop-In/Pop-Out方法，主要是利用了URA3基因所编码的酶是尿嘧啶合成的关键酶，该酶能把5-FOA（5-氟乳清酸）转化成对细胞有毒的物质，使得带有URA3基因的菌株不能在含有5-FOA的培养基上生长，而缺失URA3基因的酵母则不能在尿嘧啶缺陷的培养基上生长。

一般的方法是将一个带两个标记基因（URA3以及两端含被敲除基因同源臂的编码营养物的基因，以ADE为例）的Pop-In/Pop-Out载体通过同源重组转入相应的营养缺陷型的毕赤酵母菌株，通过两次同源重组实现对目的基因敲除。第一次重组后两个标记基因都进入毕赤酵母染色体，此时可用含有5-FOA的培养基进行筛选。然后将不能在5-FOA的培养基生长的重组菌在丰富培养基中培养扩增，其中一些重组菌由于染色体中重复的两个同源臂序列之间发生同源交换，导致染色体上包括URA基因在内的敲除质粒骨架序列的切除以及重复区段中两个拷贝之一的丢失，即发生了二次重组。二次重组可能产生两种菌：不含两种筛选标记基因的野生型菌株与保留了ADE基因的成功敲除目的基因的重组菌。最后通腺嘌呤缺陷的含5-FOA的培养基进行二次筛选，得到敲除成功的菌株。原理如图3所示。

图3 URA3作为反向筛选标记的Pop-in/Pop-out方法[4]

图中敲除质粒的ADE1基因可根据被敲除菌株的特性替换成相应的标记基因，其起到辅助筛选的作用，可大大降低筛选的工作量，提高筛选突变株的效率。而URA3是一个不可替代的关键性筛选标记，可作为一种正负筛选标记使用。在插入ADE1基因的位置上也可以不引入筛选标记基因，只利用URA3单个筛选标记利用两步置换的方法在敲除目标基因是可行的，但是这种方法在筛选突变株时会增加筛选的工作量。

利用URA3作为反向筛选标记两步重组敲除基因的方法有一个缺点：即使是在提供了尿嘧啶的培养基里，巴斯德毕赤酵母尿嘧啶营养缺陷型菌株依然生长得很慢。这可能是因为尿嘧啶营养缺陷型的巴斯德毕赤酵母不能很好地利用培养基里的尿嘧啶。由于生长缓慢的限制，这样的菌株很难作为生产工程菌在工业上的广泛应用。

2.2 T-urf13（专化玉米T型胞质不育基因）作为反向筛选标记

来自雄性不育玉米的线粒体基因组的T-urf13 基因，编码一个赋予细胞T-型雄性不育特性的13-kD 的多肽［5］。早前的研究发现含该基因的酿酒酵母重组菌细胞对杀虫剂灭多虫很敏感，同时在普通的生长条件下该重组菌几乎不体现任何生长受抑制的现象，并且这一发现在巴斯德毕赤酵母身上也非常相似［2］。因而条件致死的T-urf13基因可作为替代URA3的反向筛选标记，避免了生长缓慢的尿嘧啶营养缺陷型巴斯德毕赤酵母重组菌的产生，得到二次重组后的基因敲除菌。

这一方法也是先构建一个含T-urf13基因与正向筛选标记基因的敲除质粒，然后转入毕赤酵母重组菌中。再利用正向筛选标记筛选得到第一次重组成功的阳性转化子，并将其在含methomyl的培养基进行反向筛选。载体上的T-urf13反向筛选标记使菌株在灭多虫平板上致死。同时，在这种致死压力下，宿主为了存活下来，迫使插入载体在内部发生双交换同源重组，去除插入载体［6］。只有去除了插入载体的重组菌才能在methomyl 平板上存活。原理图如下所示：

图4 T-urf13作为反向筛选标记的Pop-in/Pop-out[1]

图中的正向筛选标记sh ble基因可用其他正向筛选标记替代。

然而，T-urf13基因的毒性使得转化的菌株很少能存活，并因某些基因被删除可能导致条件致死，从而限制了该方法的推广使用。

2.3 Cre-loxP重组系统

Cre-loxP重组系统在酿酒酵母中已经使用得比较成熟，2008年被作为一种快速和方便的实现无标记基因删除的方法在在巴斯德毕赤酵母中应用。

Cre/mutated lox 系统、Zeocin 抗性标记和同源臂通过融合PCR 被叠接在一起，构成基因删除盒子（同源区域-lox71-Cre-ZeoR-lox66-同源区域），这个能通过同源重组整合到巴斯德毕赤酵母基因组上。把双交换的重组子转移到甲醇诱导的培养基后，Cre 重组酶的瞬时表达导致lox71-Cre-ZeoR-lox66 片段变成一个双突变的lox72 位点的重组反应，从而从巴斯德毕赤酵母基因组中删了Cre-ZeoR盒子。原理图如下：

图5 （a）Cre-loxP系统.（b）Cre-ZeoR盒子.（c）该非标记的基因删除策略.[7]

Cre-loxP重组系统已被成功用于引起单基因或者双基因的删除。2011年，南京农业大学的研究人员在巴斯德毕赤酵母基因组里用进行了HIS4基因的成功敲除，并在这个重组菌的基础上进一步实现PEP4基因的敲除［6］。而且二次敲除中，前次留下的双突变lox72位点没有影响后来引入的删除盒lox71与lox66之间的在Cre重组酶调节的重组。

近年来，Cre-loxP重组系统已经被广泛用于多种生物体里。38-kDa的Cre蛋白催化两个loxP位点之间的辅助因子独立的重组。当两个loxP位点被放置相同的方向，Cre介导的重组可以删除他们侧面的基因序列，同时留下一个loxP在后面。然而，当反复地使用这系统在同一基因背景里，一个共同的关注点是可能的重组会发生在新引进的loxP位点和前面的留在基因组里loxP位点。为了解决这个难题，突变loxP片段被产生。特别流行的是lox71和lox66，每一个都包含着一个5-bp改变在回文序列。lox71和lox66的重组导致一个天然的loxP位点和一个双突变的lox72位点。留在在染色体上的双突变的lox72位点对Cre重组酶显示出着强还原的结合能力，同时几乎不参加序列重组。所以这个方法可以被连续地用来中断巴斯德毕赤酵母的基因，而不需要引入筛选标记。

2.4 另一种Pop-In/Pop-Out方法

利用反向筛选标记的两步法同源重组实现毕赤酵母基因敲除的方法，都是基于敲除质粒的构建去引入同源臂，然后在生长压力条件下，利用两拷贝同源臂之间的相同序列实现二次重组，再利用标记基因筛选出基因敲除后的重组菌。为了提高筛选效率，常根据被敲除的宿主菌的性质同时引入一个正向筛选标记，进行正反向筛选。URA3基因与T-urf13基因是两个常用作Pop-In/Pop-Out方法里的反向筛选标记，但由于它们分别给重组毕赤酵母带来的生长缓慢以及毒性导致的低存活率都限制了这两种反向标记实现非标记敲除基因方法的应用。

大肠杆菌的mazF 作为一种新的反向筛选标志被用于巴斯德毕赤酵母的Pop-In/Pop-Out 敲除基因［8］。mazF编码一个毒素MazF，这是一个重要的毒素-抗血清系统，介导的细胞程序性死亡。MazF作为一种mRNA干扰酶，会优先切断在ACA（特定序列）上的单链mRNA以阻止蛋白合成，导致细胞生长阻遏［9］。

mazF基因被放置在诱导的表达系统里，同时Zeocin抗性基因作为一个正向的筛选标志。但是一般用于在功能基因片段中插入一段序列，以破坏该基因的正常转录与翻译，从而实现基因的功能缺失。

3 位点特异性的核酸酶系统

近十年来发展了一种新的研究手段，可以对各种细胞和各种生物体内的几乎任意基因进行人工操作，这种新技术被称为“基因组编辑技术（genome editing）”，由序列特异性的DNA结合结构域与非特异性的DNA切割结构域组合而成的人工核酸酶就是基因组编辑技术的重要组成部分。这些嵌合式的核酸酶能够以极高的效率、极高的精确度对基因组进行人工修饰［10］。

ZFN（锌指核糖核酸酶，Zinc-finger nucleases）是由FokI 限制性核酸内切酶当中的非特异性的DNA 切割结构域和锌指蛋白（zinc-nger protein）组合而成的。ZFN 二聚体（dimers）能够促使DNA 断裂形成DSB（double-strand breaks，DNA双链断裂缺口），，进而诱发DSB修复机制。锌指结构域的靶向功能使ZFN能够对基因组中的特定位点进行定向改造。TALEN（转录激活因子样效应因子核酸酶，transcription activator-like effector nuclease）主要由Fok I内切酶结构域和TALE蛋白的DNA结合结构域组合而成。TALE蛋白含有多个33-35个氨基酸组成的重复肽段，而每一个肽段都能够识别一个碱基。与ZFN 一样，TALEN 也能使DNA 靶序列断裂，形成DSB，进而激活DNA损伤修复机制，对基因组进行定点改造。

ZFN 和TALEN 都可以对DNA 进行各种遗传修饰，它们的作用机制都是先对DNA 双链分子进行切割，形成DNA双链断裂切口，然后激活细胞内的非同源末端连接修复机制，或者同源重组修复机制，再利用细胞自身的修复机制对DNA进行遗传学修饰。

在细胞内转入位点特异性的核酸酶和携带有位点特异性同源序列的外源质粒，能够以极高的效率在细胞基因组特定的位点转入一个或者多个转基因序列（图6A）。通过这种方法，可以转入一段不超过50bp的线性外源同源序列或者单链的DNA寡核苷酸链，在细胞基因组内的特定位点引入替换突变、缺失突变或者插入突变。位点特异性的核酸酶除了能够提高同源重组的效率之外，还能够以很快的速度构建null表型（null phenotype）的细胞系和模式生物。这些核酸酶产生DSB之后如果启动了NHEJ（非同源末端连接修复机制）修复机制，那么就会在DSB位点处引入小段的缺失突变或者是插入突变，使基因发生移码，从而起到敲除基因功能的作用（图6B）。这些位点特异性的核酸酶还能够引入大段的染色体缺失突变，使染色体发生大段的倒位（inversion）和转位（translocation）。

图6 A/B使用位点特异性核酸酶进行基因组编辑操作。

核酸酶切割DNA 形成DSB 之后细胞可能会借助同源重组修复途径，或者是NHEJ（非同源末端连接修复机制）修复途径对DSB进行修复。（A）在缺乏外源质粒DNA模版的情况下，细胞会通过NHEJ机制进行修复，在基因组中形成小型的插入或者缺失突变。在存在双链寡聚核苷酸分子，或者在细胞内存在线性的质粒片段时，可以通过NHEJ机制在基因组中插入大段的DNA序列，最长可以插入14kb的序列。同时形成两种DSB之后会形成缺失、倒位或者倒位的序列转位等突变。（B）在存在同源序列的外源模版的情况下，细胞会通过同源重组修复机制修复DSB，在基因组内插入1个或者多个转基因，或者对基因组中的错误基因进行修复［10］。

4 展望

巴斯德毕赤酵母表达系统，弥补了大肠杆菌表达系统不易表达复杂蛋白的限制以及植物、动物细胞表达系统周期长、操作繁琐、成本高的缺点，完善了酿酒酵母分泌效率低、表达菌株不够稳定、表达质粒易丢失等缺陷，是一种优秀外源蛋白表达系统。但其自身还存在着表达人源性蛋白时过糖基化等缺点，仍有待进一步优化。

基因敲除是酵母研究中最有效和最重要的技术之一。对于酿酒酵母的基因敲除技术发展得比较成熟，酿酒酵母的基因敲除只需几十至几百个碱基的同源臂序列，且敲除效率较高；而对于毕赤酵母而言，基因敲除需要几百乃至上千个碱基的同源臂序列，且敲除效率远低于酿酒酵母，尤其是对于一些影响菌体生长、代谢的基因，其敲除效率很低，往往难以获得正确敲除的菌株。因而，寻找高效的巴斯德毕赤酵母基因敲除方法对进一步研究和优化巴斯德蛋白表达系统有着重要的意义。

有标记的插入替换基因缺失方法操作简单，比较容易筛选得到基因缺失菌。目前在毕赤酵母中可用的筛选标记有限，因而有标记的插入替换方法在进行多基因缺失时具有一定的局限性。无标记的Pop-In/Pop-Out方法相对比较复杂，筛选工作量大。但是在基因缺失后，宿主菌的染色体上不会留下任何外源片段，特别适合多基因缺失或是改造基因工程菌。

URA3、T-urf13、mazF 基因作为反向筛选标记的Pop-In/Pop-Out 方法敲除基因，是基于敲除质粒的构建去引入同源臂，然后在生长压力条件下，利用两拷贝同源臂之间的相同序列实现二次重组，再利用标记基因筛选出基因敲除后的重组菌。为了提高筛选效率，常根据被敲除的宿主菌的性质同时引入一个正向筛选标记，进行正反向筛选。但在标记删除达到之前时常需要多于10天的时间，比较耗时。

同样是通过两步同源重组实现基因敲除，Cre-loxP重组系统不依赖于敲除质粒的构建，而是通过构建删除表达盒。Cre-loxP 重组系统只需引入一个正向筛选标记，同时它的二次重组是依赖于Cre 重组酶催化的loxP71 与loxP66之间的重组，只需启动Cre的转录翻译即可，较需要生长压力条件来实现菌体自身二次重组的反向筛选标记的方法要简单、快捷。因而，Cre-loxP重组系统在巴斯德毕赤酵母的基因敲除方法中具有巨大的应用前景，为进一步优化多基因缺失与改造毕赤酵母基因工程菌的方法提供了思路。

序列特异性的DNA结合结构域与非特异性的DNA切割结构域组合而成的人工核酸酶是基因组编辑技术的重要组成部分，ZFN和TALEN等嵌合式的核酸酶能够以极高的效率、极高的精确度对基因组进行人工修饰。

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