烟草雄性不育未受精胚珠离体培养和植株再生

曹景林，程君奇，李亚培，吴成林，王 欣

湖北省烟草科学研究院，武汉市硚口区宝丰路6 号 430030

近年来，单倍体育种在作物育种中得到了广泛的应用，其作为现代高效育种体系的重要组成部分，具有缩短育种年限、提高选择效率等优点［1-3］。通常，可以通过体外培养花药或小孢子产生单倍体，即花药起源的单倍体，也称作雄性单倍体。该技术在白菜、菜花等蔬菜作物育种中广泛应用［4-5］，但茄科类作物如茄子［6］、马铃薯［7］的小孢子培养难度大，大多研究仍停留在愈伤组织或类胚状体阶段。而同为茄科作物的烟草是重要的经济作物，早在20 世纪中后期美国烟草育种工作者在利用花药或小孢子体外培养诱导单倍体方面取得了很大的进展，技术日臻完善［8］。但研究发现，花药起源的单倍体经加倍后往往产量和品质性状劣化严重，育种利用的价值有限，再加上这类单倍体的加倍频率很低，通常只有1%左右，目前这种方法在烟草育种中已很少使用［9］。

产生烟草单倍体的另一种方法是离体培养子房或胚珠，即卵细胞起源的单倍体，也称作雌性单倍体。这种单倍体经加倍后倍性和性状变异小，后代较稳定［10］，由于采用子房或胚珠为外植体进行培养，不牵涉及花粉，因此这种技术适用于雄性不育植物［11］。即使从雄性不育植物的雌性双单倍体植株得不到种子，也可以利用组培技术扩繁种苗，或直接用于生产，或作为杂交种亲本使用。Wernsman等［12］于1979 年开始烟草未授粉子房培养研究，并成功获得了单倍体植株。将烟草雌性单倍体和雄性单倍体加倍后的双单倍体与来源亲本进行了比较发现，雌性双单倍体优于雄性双单倍体，雌性双单倍体与来源亲本更相似，不会造成产量和品质的劣变［13］。若采用杂交种未受精卵细胞培养，则获得的双二倍体品系与常规自交相似［9,13］。目前，这种技术已成功应用于烟草育种中［9］。祝仲纯等［14-16］曾对普通烟草品种Copusyeusuheku No.4、NC2326、革新五号等进行了未授粉子房培养，以子房为外植体直接将子房接种于H 培养基（附加生长素IAA 0.5 mg/L 和细胞分裂素KT 2 mg/L）上培养，仅Copusyeusuheku No.4通过子房培养获得单倍体植株。吴伯骥等［17］对普通烟草品种柳叶烟、金星烟、黄苗榆和黄花烟草品种甘肃黄花烟进行了未授粉子房培养，直接将子房接种于改良的H 培养基（附加生长素IAA 0.5 mg/L 和细胞分裂素6-BA 2 mg/L）上培养，获得了单倍体植株。祝仲纯等［18］采用N6培养基（附加生长素IAA 0.5 mg/L、细胞分裂素KT 6 mg/L、肌醇100 mg/L和蔗糖8 g/L）对大叶黄烟未传粉子房进行了培养，获得了再生植株，但频率低，仅占4%。虽然提高培养基中生长素用量后能够诱导出旺盛的愈伤组织，然后分化出大量的幼苗，但产生单倍体植株的频率低。潘莉等［19］采用附加2,4-D 和6-BA 的H 培养基对普通烟草品种NC89未传粉子房进行了培养，发现不同6-BA浓度对子房生长的影响不同，6-BA浓度为8.89 μmol/L时，子房能够直接产生胚状体进而形成小苗。上述研究均以花粉发育时期为依据，对可育纯系品种的子房进行培养，而有关雄性不育杂交种未传粉子房的培养，尤其是通过未受精胚珠培养获得雄性不育烟草单倍体植株的研究至今鲜见报道。为此，在前人研究的基础上，开展了KRK26未受精胚珠培养试验，旨在通过不同培养基类型的筛选，确定最适于培养的子房发育时期和外植体形式，为利用烟草胚珠高频率诱导单倍体植株提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

以津巴布韦引进的雄性不育烤烟杂交种KRK26的未授粉胚珠为材料。为了保证整个试验期间均能得到胚珠，将烟草分两期播种和盆栽，间隔30 d，采用的栽烟盆内径为30 cm，每次盆栽100株。

1.2 试验方法

1.2.1 适宜发育时期和外植体形式的确定

在烟草开花期，选取5 个不同发育时期（图1，K1～K5）的胚珠进行培养，筛选胚珠离体培养的最佳发育时期，并参考文献［10］的方法，将不同发育时期（即K1～K5）的子房制作成厚度为6～8 µm 的石蜡切片，并将切片置于显微镜（DM 2500，德国Leica公司）下，观察并拍照各个时期胚囊的发育情况，从细胞水平选取最佳发育时期。

图1 5个发育时期的胚珠对应的花蕾状态Fig.1 Flower bud states corresponding to ovules at five development stages

将采集的5个时期的花蕾放入1 g/L的升汞溶液中消毒7～9 min，然后用无菌水冲洗3～4次，随之在无菌条件下将消毒后的花蕾基部切掉，分别用镊子挤出子房。并将每个时期的子房分成3部分，分别进行环切子房、去除子房壁和直接剥离胚珠3种处理，作为外植体分别放入不同的装有培养基的培养皿中进行接种培养。

1.2.2 适宜培养基的筛选

以H培养基［20］、吴伯骥等［17］改良的H培养基（用HW表示）和N6培养基［21］为基础，对胚珠离体培养基进行优化，共设置5 种优化培养基配方，见表1。采用上述环切子房、去除子房壁的子房和直接剥离的胚珠作为外植体进行胚状体诱导，从中筛选出最优培养基并用于单倍体诱导。

1.2.3 再生单倍体植株的诱导

采用筛选出的最优培养基和最适宜的外植体进行胚状体诱导，并根据胚状体诱导实际情况结合前人研究经验，对培养基配方进行微调整，以利于再生芽的诱导。以5种优化培养基为对照，培养基配方微调设置5个处理：①培养基中不加激素、无机盐浓度减半、不加激素且无机盐浓度减半，共3种配方。②将培养基中的蔗糖浓度由20 g/L 增加到40 g/L；③将培养基中的琼脂浓度由8 g/L增加到10 g/L；④将培养基中的细胞分裂素浓度由2 mg/L降低到1.5 mg/L；⑤将培养基的pH 由5.5 提高到5.8。确定最终的胚状体诱导培养基配方和再生芽诱导培养基配方。将诱导出的胚状体转移到最终确定的再生芽诱导培养基上培养，以诱导胚状体产生再生芽。最后，将再生芽分植于附加有IAA 10 mg/L的H培养基或N6培养基上培养，以获得再生植株。

于28 ℃光照培养室中，每天在1 500 lx 连续光照培养10 h 的条件下进行胚状体诱导、再生芽诱导和生根诱导。

1.2.4 再生单倍体植株的鉴定

于再生植株长至2～3 cm 高或3～4 片叶时，取再生植株叶片，利用流式细胞仪（BD FACSCalibur，美国BD 公司）进行倍性确定。具体方法：取再生植株约1.3～1.6 cm2幼叶，在0.5 mL 的细胞裂解液（Tris-HCl buffer，pH=7.2）中用刀片切碎，把样品和溶液混合物通过孔径30 µm 微孔膜过滤到测试管中，加20µL DAPI染色液［137 mmol/L NaCl，2.7 mmol/L KCl，4.3 mmol/L Na2HPO4，1.47 mmol/L KH2PO4，0.4 µg Propidium iodide（PI,美国Sigma 公司），1 g/L tritonX-100 和4 µg RNAse A］染色15 min，然后上样。以正常的子房供体植株DNA含量作为对照，调节到40 Channels。每个曲线峰至少分析10 000个细胞，重复4次。

2 结果与分析

2.1 未受精胚珠培养适宜发育时期的确定

通过石蜡切片（图2）观察可知，5 个不同发育时期（即K1～K5）的花蕾子房内胚珠的发育情况大体是：K1—成熟胚囊；K2—四核和八核期；K3—二核期；K4—单核期；K5—大孢子母细胞时期。

图2 不同发育阶段胚珠的胚囊发育情况Fig.2 Development of embryo sac of ovule at different development stages

将子房消毒后，采用几种不同方式的外植体进行培养，包括环切子房、去除子房壁和直接剥离胚珠后进行接种培养。环切子房接种培养7 d 后可观察到外露的胚珠明显膨大，带有子房壁的外植体子房壁变绿增厚，未观察到子房壁破裂现象，内部胚珠基本没有膨大迹象，此时将子房壁去除在培养过程中胚珠仍然褐化死亡；去除子房壁和直接剥离胚珠后进行接种培养7 d 后能观察到胚珠明显增大。不同发育时期胚珠在培养过程中膨大的外植体率如图3所示。

图3 培养过程中不同发育时期胚珠膨大的外植体率Fig.3 Expanded explant rate of ovule at different development stages during culture

由图3可知，在不同培养基中从K1至K5各发育时期的胚珠膨大的外植体率均呈上升趋势。发育时期为K5的胚珠在不同培养基上均表现最佳，所有外植体基本都存在胚珠膨大，且膨大的胚珠比例最高。所以，在所试验范围内胚囊发育越成熟，胚珠的增殖诱导越差。综合来看，胚珠发育处于K3～K5时期接种情况最好，即取发育在大孢子母细胞时期到二核期之间的胚珠进行培养最佳。因此，应摘取发育较早的花蕾，进而采集发育时期较早的胚珠较有利于培养。

2.2 未受精胚珠培养适宜培养基的优化

采用表1中的5种培养基培养未受精胚珠，结果（图4）表明，培养基CM1、CM2、CM4 的培养效果均较佳，且以CM1的培养效果最佳。基本培养基同为HW时，附加有细胞分裂素6-BA的培养基（CM4）的诱导效果比附加有KT 的培养基（CM2）略好。培养基CM1 和CM2 都能通过直接发生途径诱导出大量的胚状体，而胚珠在CM4（附加IAA 0.5 mg/L +6-BA 2 mg/L）培养基上并不直接产生胚状体，而是先形成愈伤组织再分化成胚状体，即通过间接途径出苗，延长了胚状体诱导的时间。N6培养基上除K5时期的胚珠外，其他外植体产生膨大胚珠的比例极小，而且外植体褐化死亡现象严重。而加有活性炭的培养基CM3 培养效果最差，若外植体为子房，则仅见子房壁变绿增厚，但无论外植体为子房还是胚珠，均未见有明显膨大的胚珠。

图4 不同培养基对烟草雄性不育杂交种KRK26未受精胚珠的培养效果Fig.4 Effects of different media on culture of unfertilized ovules of tobacco male sterile hybrid KRK26

2.3 再生单倍体植株的诱导

采用KRK26 未授粉的K3～K5 时期花蕾，直接剥取胚珠接种于培养基CM1 上，15 d 后可见胚珠明显膨大（图5A）；培养30 d后得到胚状体。

图5 未受精胚珠诱导单倍体再生植株的过程Fig.5 Induction of regeneration of haploid plants from unfertilized ovules

将获得的胚状体继续培养14 d 左右，胚状体开始伸长，明显形成两极（图5B）；随后，大部分极性胚分化至类似子叶胚状，有少数外形类似小苗（图5C和5D）；将小苗分植于生根培养基上进行促根培养（图4E）；培养14 d左右再生芽开始生根，长势良好，培养20 d左右可见完整的再生植株（图5F和5G）。

本试验中，一些胚状体出现玻璃化。为此，尝试通过提高蔗糖浓度（20→40 g/L），pH（5.5→5.8）和琼脂浓度（8→10 g/L），同时降低细胞分裂素浓度（2→1.5 mg/L）来抑制玻璃苗的发生。结果发现，这几种方法都能抑制玻璃苗的发生，但除了10 g/L 琼脂浓度的培养基对生长无影响外，其他的培养基都对胚状体生长不利。因此，在胚状体和再生芽诱导中，将CM1培养基中的琼脂浓度调整为10 g/L。

CM1培养基虽然能通过直接发生途径诱导出大量的胚状体，但胚状体在培养过程中逐渐褐化，为此，尝试了将胚状体转移到不加激素的1/2 CM1（即CM1 培养基的无机盐浓度减少一半）和不加激素的CM1 培养基（即H 培养基）上继续培养，结果发现将培养基CM1 中激素去除能有效抑制胚状体的褐化。同时，胚状体能伸长并长出须状叶，缓慢发育，部分处于K3、K4、K5时期胚珠诱导出的胚状体在不含激素的CM1 培养基（即H 培养基）上逐渐发育成瘦弱的小苗（即再生芽）。随后，将再生芽转入附加有IAA 10 mg/L 的H 培养基或N6培养基上培养，发现再生芽能够很快生根，长势良好，进而获得大量的再生植株。

2.4 单倍体的鉴定与植株表现

通过胚珠培养得到了大量植株，因植株形态各异，不能确定再生植株的倍性，因此采用流式细胞仪对再生植株进行倍性鉴定（图6）。鉴定结果（图7A）发现，大部分植株为单倍体植株。在检测的855株再生植株中有647株为单倍体植株，单倍体植株率达到75.67%，其中尤以源于大孢子母细胞时期胚珠的再生植株中单倍体植株率最高，达到77.91%。所有的单倍体植株的幼苗长势均缓慢，叶片数量、大小以及株高远不如亲本植株。部分单倍体植株在培养基中长时间培养后出现顶芽坏死现象（图7B）。将单倍体植株移入温室中培养，发现单倍体植株长势较弱（图7C），但也能正常开花，为雄性不育（图7D）。

图6 再生单倍体植株的形态及流式细胞仪倍性鉴定Fig.6 Morphology of regenerated haploid plants and identification of their ploidy by flow cytometry

图7 KRK26未受精胚珠培养获得的单倍体植株长势与开花Fig.7 Growth and flowering of haploid plants obtained from unfertilized ovule culture of KRK26

3 讨论

本研究中发现，在合适条件下培养未受精的烟草胚珠可以长成植株，而且能不经愈伤组织直接长成植株，这样可以避免经过愈伤组织而产生染色体的多样畸变。这与祝仲纯等［14］、吴伯骥等［17］的研究结果一致。但他们是用未授粉子房直接诱导的，而本试验中采用未授粉子房诱导时，观察到子房壁变绿增厚，但内部胚珠基本没有膨大迹象，此时将子房壁去除后在培养过程中胚珠仍然褐化死亡。若采取去除子房壁再接种或直接剥取胚珠接种，则能够观察到胚珠膨大，分化成许多极性胚，并逐渐长成植株。这可能是由于本试验中使用的是雄性不育材料所致。

祝仲纯等［14］和吴伯骥等［17］在花粉单核晚期或双核期时采集未授粉子房培养，能够取得较好的诱导效果，得到再生植株。但本试验中采用的是雄性不育材料，无法根据花粉发育时期判定采集外植体的时期，因此采用花蕾外观来评判胚珠的发育时期。胚囊发育越成熟，胚珠的增殖诱导能力越差，以发育在大孢子母细胞时期到二核期之间的胚珠，也就是发育较早的花蕾即花朵的花冠即将露出花萼时期至花冠比花萼长1 倍时期的胚珠诱导能力最佳。该时期胚珠培养产生的胚状体的起源可能有3种情况，一是直接起源于大孢子母细胞，大孢子母细胞减数分裂，再增殖形成细胞团，再发育成胚状体；二是起源于大孢子细胞，大孢子分裂增殖形成细胞团，再发育成胚状体；三是起源于卵细胞，胚珠接种后会遵循胚囊发育途径形成正常的成熟胚囊，再由其中的卵细胞发育成胚状体［10］。

祝仲纯等［18］曾用N6培养基得到很好的培养结果，但本试验中采用N6培养基（CM5），除K5 时期胚珠外其他外植体产生膨大胚珠的比例极低，外植体褐化死亡现象严重，未能得到再生植株。原因可能为：①基本培养N6的营养成分与H 培养基相比有较大不同；②琼脂的浓度相比于其他类型培养基高出2 g/L，配制的培养基偏硬，不利于营养物质的吸收；③蔗糖的浓度为80 g/L，比其他类型培养基高3 倍。蔗糖在培养中除提供碳源外另一个重要的作用是调节渗透压，影响细胞对物质的吸收。潘莉等［22］也证实蔗糖浓度高于40 g/L 时会抑制胚状体的诱导，在黄瓜未受粉子房培养中有研究表明蔗糖浓度低有利于胚囊内细胞的分裂增殖［23］。本试验中还发现，培养基CM1 培养效果最好，其次是CM2 培养基，采用这两种培养基均可通过直接途径得到单倍体再生植株。这与祝仲纯等［14-16］、吴伯骥等［17］的研究结果一致。胚珠在CM4培养基（IAA 0.5 mg/L+6-BA 2 mg/L）的发育也较好，可以通过间接途径出苗，这与潘莉等［19］报道的结果一致。烟草未授粉胚珠培养分为直接途径和间接途径，直接途径就是胚珠直接发育成胚状体再成苗，而间接途径是先形成愈伤组织再分化成胚状体，最后成苗［19］。在供试的各种培养基中，加有活性炭的培养基CM3培养效果最差，其原因有待于进一步探讨。

本研究中所获得的单倍体植株的幼苗长势缓慢，叶片数量和大小以及株高远不如亲本植株。因此，在对再生植株进行倍性鉴定时，可根据再生植株幼苗的长势长相，预先淘汰掉明显不是单倍体的植株，仅对长势缓慢，叶片数量和大小以及株高远不如亲本的再生植株进行倍性鉴定，可减少工作量。但如何将获得的单倍体植株高频率地加倍成双二倍体，并能快速繁殖，尚有待进一步研究。

4 结论

以烟草雄性不育杂交种KRK26为材料，建立了从雄性不育烟草未受精胚珠诱导单倍体植株的培养体系。采集发育阶段处于大孢子母细胞时期到二核期之间的胚珠，即花朵的花冠将露出花萼时期至花冠比花萼长1倍时期的胚珠作为外植体，接种于附加生长素IAA 0.5 mg/L 和细胞分裂素KT 2 mg/L 的H培养基上以诱导产生胚状体，培养基中蔗糖和琼脂的终浓度分别是20 g/L 和10 g/L；将产生的胚状体转移到不含激素的H 培养基上继续培养，以诱导产生再生芽，再生芽诱导培养基中蔗糖和琼脂的终浓度同样分别为20 g/L 和10 g/L；将形成的再生芽分植于附加生长素IAA 10 mg/L的H培养基或N6培养基上培养，以促进再生芽生根，获得再生植株，再生芽生根培养基中蔗糖和琼脂的终浓度分别是80和8 g/L。最后，对再生植株进行倍性鉴定，挑选出单倍体植株以进行加倍。