一株枯草芽胞杆菌L249 的分离鉴定及对烟草赤星病的盆栽防效

胡 珊，彭剑涛，2，莫维弟，周志成，丁海霞，彭丽娟*，2

1.贵州大学烟草学院，贵阳市花溪区花溪大道南段2708 号 550025

2.贵州省烟草品质研究重点实验室，贵阳市花溪区花溪大道南段2708 号 550025

3.贵州大学农学院，贵阳市花溪区花溪大道南段2708 号 550025

由链格孢菌（Alternaria alternata）引起的烟草赤星病主要危害成熟期的烤烟上部叶，发病严重地块几乎绝收，严重影响烟叶产质量［1］。目前化学防治依然是防治烟草赤星病的主要措施，然而长期使用化学药剂易造成环境污染、农药残留和危害人畜健康等问题，且近年来有研究报道链格孢菌对96%（质量分数）苯醚甲环唑和97%（质量分数）氟环唑［2］及93%（质量分数）菌核净［3］等药剂已产生抗药性。而生物防治具有无毒、无残留和对环境友好等优点，成为植物病害防治研究的热点之一。

目前，植物病害生物防治中应用最广泛的为芽胞杆菌属细菌，因其有抗菌谱广、耐盐性强、能产生多种拮抗作用酶、繁殖快、抗逆性强和生物安全性高等优点，具有较高应用价值［4］。宋莉莎等［5］从贵州省瓮安县烟区土壤中筛选具有拮抗作用的细菌发现，甲基营养型芽胞杆菌（Bacillus methylotrophicus）对链格孢菌有较强的抑制作用，其无菌发酵液对该病菌抑菌带可达23.5 mm。王雯丽等［6］从福建、山东和云南等地烟草叶片中分离得到187 株菌株，发现萎缩芽胞杆菌（Bacillus atrophaeus）与贝莱斯芽胞杆菌（Bacillus velezensis）分泌的脂肽类物质对链格孢菌菌丝生长也有明显抑制作用，抑制率分别为56.9%和65.0%。前期调查发现，贵州省清镇市卫城镇烟区烟草赤星病发生严重，部分地块发病率高达100%，几乎绝收，给当地烟农造成巨大经济损失。为筛选对该地区烟草赤星病具有拮抗作用的菌株，采用5点取样法，从贵州省清镇市卫城镇烟草赤星病发生严重地块采集健康烟株根际土壤，带回实验室进行芽胞杆菌分离纯化，使用平板对峙法筛选对病原真菌具有较好拮抗作用的菌株，根据形态特征、生理生化指标及构建系统发育树对其进行鉴定，并通过盆栽试验测定该拮抗菌对烟草赤星病防治效果，旨在为烟草赤星病的生物防治提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

供试土样采集于贵州省清镇市卫城镇烟草赤星病发生严重地块健康烤烟根际，采用5点取样法取样后用无菌自封袋封存并编号。供试病原菌为链格孢菌（Alternaria alternata）、高粱叶点霉菌（Phyllosticta sorghina）、大斑突脐蠕孢菌（Exserohilum turcicum）、烟草炭疽菌（Colletotrichum nicotianae）和尖孢镰孢菌（Fusarium oxysporum），均由贵州大学烟草学院病理实验室保存并提供。供试烤烟品种为K326，选用长53 mm、宽35 mm、高58 mm 规格的育苗盆育苗，每盆1 株，待烤烟幼苗生长至5 片真叶时，移栽至底径为140 mm、口径180 mm、高160 mm 花盆中继续生长至8～ 10片叶备用。

供试药剂为10%苯醚甲环唑水分散粒剂（WDG）（先正达南通作物保护有限公司），供试试剂有1%（质量分数）草酸铵结晶紫、明胶及9%（质量分数）NaCl溶液等。

1.2 方法

1.2.1 土壤拮抗菌分离

采用稀释涂布平板法［7］，称取10 g 土样放入含90 mL 无菌水的锥形瓶中，置于37 ℃、200 r/min 恒温摇床振荡20 min。85 ℃水浴处理10 min 后梯度稀释得到浓度为10-2、10-3、10-4和10-5的土壤悬浮液。取100 μL稀释液均匀涂布于LB平板，各浓度3个重复，于37 ℃恒温培养箱中过夜培养。待平板长出单菌落后，挑取形态不同的单菌落纯化后编号，置于LB 液体培养基中37 ℃振荡培养24 h 后，与30%（体积分数）甘油等比例混合后置于冻存管中，-80 ℃保存备用。

1.2.2 拮抗菌抑菌谱测定

将5 种植物病原真菌在PDA 培养基上培养7 d后，分别取直径为6 mm 的菌饼接种到PDA 平板中央（培养皿直径为85 mm），距中央2.5 cm 处再接种5 µL拮抗菌菌液，以只接种病原菌的PDA平板为对照，每种病原菌接种4 个培养皿，重复3 次（下同）。待对照长满培养皿后，测量抑菌带宽度并挑取链格孢菌边缘菌丝，置于Axio Imager M2 蔡司金相显微镜（德国Carl Zeiss Microscopy GmbH 公司）下观察菌丝形态。采用十字交叉法［8］测量菌落直径，并计算菌丝生长抑制率。

1.2.3 拮抗菌生长曲线测定

将保存的拮抗菌活化后挑取单菌落接种到装有5 mL LB 培养液的试管中，置于37 ℃、200 r/min 条件下的摇床中培养12 h 后，获得种子液。使用移液枪吸取1 mL 种子液接种于100 mL 的LB 培养液中进行培养，采用比浊法［9］，每隔30 min用分光光度计在600 nm 波长处测定菌液的吸光度值（OD），直至OD值缓慢下降时停止测量。

1.2.4 生物膜测定

参照Hamon 等［10］测定生物膜的方法，将活化的芽胞杆菌接种于LB培养基中，37 ℃、200 r/min培养至OD600约为1.0 时，4 ℃离心收集菌体，用无菌水洗涤后重悬于等体积的MSgg 培养基中。取5 mL MSgg 培养基加入12 孔细胞培养板中，然后分别滴加10 µL菌悬液，于37 ℃静置培养24 h后观察成膜情况。

1.2.5 拮抗菌生防相关酶类测定

将筛选出具有良好拮抗作用的菌株接种于LB液体培养基中，置于37 ℃、200 r/min 的摇床中过夜培养后，滴加5 µL菌液至蛋白酶检测培养基和纤维素酶检测培养基中央，37 ℃培养箱中培养24 h后观察菌落周围是否产生消解圈。

1.2.6 拮抗菌鉴定

结合形态特征、生理生化指标及构建系统发育树分析方法对筛选的拮抗菌进行鉴定。

（1）菌落形态观察：将活化后的菌株接种于LB液体培养基中过夜培养，取5 µL 菌液接种于LB 平板中央并置于37 ℃培养箱中过夜培养，24 h后观察菌落形态特征。

（2）生理生化指标：参考《常见细菌系统鉴定手册》［11］和《伯杰氏细菌鉴定手册》［12］，对拮抗细菌进行革兰氏染色、酶的水解、明胶的液化、柠檬酸钠盐的利用、吲哚试验、V-P试验、甲基红试验及耐盐试验等多项生理生化特征分析。

（3）16S rDNA、gyrA序列扩增及系统发育分析：使用BioTeke 细菌基因组DNA 提取试剂盒（北京百泰克生物技术有限公司），提取拮抗菌株DNA。利用细菌通用引物16S rDNA［13］及gyrA［14］对提取的细菌DNA进行PCR扩增后，采用1.0%（质量分数）琼脂糖凝胶进行电泳检测，PCR 扩增产物送生工生物工程（北京）股份有限公司测序。测序结果修正后经NCBI 进行BLAST 初步比对，根据比对结果下载亲缘关系较近的序列及模式菌株（表1），在BioEdit 7.0软件上对各菌株的序列进行修正后，以黄热厌氧芽胞杆菌（Anoxybacillus flavithermus）为外群，使用MEGA 5.0 软件并采用最大似然法（Maximum Likelihood，ML）构建多基因系统发育树［15］。

表1 用于构建系统发育树的菌株号及GenBank登录号①Tab.1 Strains used in phylogenetic analysis and their corresponding GenBank accession numbers

1.2.7 拮抗菌防治烟草赤星病盆栽试验

待烤烟生长至8～ 10 片叶时进行处理，采用喷雾法将浓度为1×108cfu/mL 的拮抗菌发酵液均匀喷施在烟草叶片正面，以液滴不滴落为标准，晾干后在叶片上接种在PDA 培养基上培养7 d、直径为6 mm 的链格孢菌菌饼，每片烟叶接种4 个菌饼。试验设4个处理：以喷施无菌水的烟株为CK1；喷施无菌水晾干后接种病原菌的烟株为CK2；喷施发酵液晾干后接种病原菌的烟株为处理3；喷施2 000 倍液10%苯醚甲环唑WDG 晾干后接种病原菌的烟株为处理4。每处理3 个重复，每个重复10 株烟苗。置于光照和黑暗各12 h、温度为28 ℃、相对湿度为90%以上的温室中培养，直至CK2 出现明显病斑时，根据赤星病病害分级标准［16］进行病害调查（以叶片为单位），并计算发病率、病情指数和相对防效。

计算公式：

1.3 数据分析

使用Excel 2010 软件对数据进行统计处理，运用DPS 数据处理系统Duncan’s 新复极差法对试验数据进行差异显著性检验。

2 结果与分析

2.1 拮抗菌的筛选及抑菌谱测定

从采集的土壤中分离纯化后共获得96 株芽胞杆菌，通过对峙培养筛选到1 株具有较好拮抗作用的菌株（图1），编号为L249。该菌对5 种植物病原真菌均具有良好抑制作用，抑制率均在60.00%以上（表2），其中对链格孢菌的抑制效果最好，抑制率达72.27%。

图1 菌株L249对4种植物病原真菌的抑制作用Fig.1 Inhibition effects of strain L249 against four plant pathogens

表2 菌株L249对5种病原真菌的抑制作用①Tab.2 Inhibition effects of strain L249 against five target fungal pathogens

培养7 d后，挑取链格孢菌菌丝在蔡司显微镜下观察，发现对照菌丝挺直，粗细均匀，而与L249对峙培养后，菌丝出现粗细不均匀、旋转结节及肿大等现象（图2）。

图2 菌株L249对链格孢菌的拮抗效果Fig.2 Antagonistic effect of strain L249 on Alteraria alternata

2.2 生长曲线测定

生长速率测定结果表明（图3），菌株L249 在0～ 2 h 内生长较慢，处于延滞期，2～ 4 h 生长逐渐加快，4 h后生长速率剧增，进入对数生长期，4～ 6 h生长速率最快，6～ 14 h 菌株生长量持续增加，14 h后OD600值达到最大。培养16～ 26 h 后菌株生长量基本保持不变，到达稳定期，26 h 以后开始下降，进入衰亡期。

图3 菌株L249的生长曲线Fig.3 Growth curve of strain L249

2.3 生物膜和生防相关酶类检测

如图4 所示，菌株L249 在液气交界处能形成复杂的生物膜结构，可在蛋白酶和纤维素酶平板上产生透明消解圈，表明该菌可产生蛋白酶和纤维素酶。

图4 菌株L249菌落形态、生物膜、蛋白酶和纤维素酶检测Fig.4 Detection of colony morphology,biofilm,protease,and cellulase of strain L249

2.4 拮抗菌L249鉴定

2.4.1 菌落形态及生理生化特性

菌落形态观察发现（图4），菌株L249在LB培养基平板上呈乳白色，菌落表面有褶皱，边缘不整齐。菌株的生理生化特征如表3 所示，菌株L249 革兰氏染色为紫色，能产生多种水解酶，明胶液化、甲基红试验及V-P试验等反应均呈阳性，柠檬酸钠盐利用、苯丙氨酸脱氢酶和吲哚试验等反应均呈阴性且具有较好的耐盐性。

表3 菌株L249的生理生化特征①Tab.3 Physiological and biochemical reactions of strain L249

2.4.2 系统发育分析

基于16S rDNA 和gyrA 基因序列构建了菌株L249 的多基因系统发育树（图5），结果显示菌株L249 与枯草芽胞杆菌（Bacillus subtilisNRRL B-4219*）聚为一支，且支持率为100%，结合其形态特征、生理生化特性及系统发育分析，将其鉴定为枯草芽胞杆菌（Bacillus subtilis）。菌株L249的16S rDNA和gyrA基因序列已提交GenBank 数据库，登录号分别为MT786346和MT802123。

图5 基于16S rDNA和gyrA基因序列构建的进化树Fig.5 Phylogenetic tree based on merged sequences of 16S rDNA and gyrA

2.5 盆栽防病试验

盆栽试验结果表明（表4），L249 发酵液对烟草赤星病具有明显防治效果，经其处理后烟株发病率和病情指数均显著低于对照，相对防效为60.66%，与10%苯醚甲环唑WDG 的相对防效无显著差异。

表4 拮抗菌L249发酵液对烟草赤星病的盆栽防治效果①Tab.4 Disease control effect of fermentation broth antagonistic strain L249 on tobacco brown spot disease in pot

3 讨论

本研究中从烟草根际分离得到一株具有较好拮抗作用的枯草芽胞杆菌L249，该菌对链格孢菌、高粱叶点霉菌、大斑突脐蠕孢菌、烟草炭疽菌及尖孢镰孢菌等5 种病原真菌均有一定抑制作用，表现出良好的广谱抑菌活性，具有潜在的生防利用价值，这与王欣悦等［17］对枯草芽胞杆菌抑菌机制的研究结果一致。对峙培养观察发现，枯草芽胞杆菌L249 可以有效抑制链格孢菌生长并造成菌丝生长稀疏和膨大畸形，这与任建雯［18］研究贝莱斯芽胞杆菌B56 与链格孢菌对峙培养后，菌丝也出现断裂增多、膨大畸形及生长速度变慢等现象相似。本研究中还发现枯草芽胞杆菌L249 能形成生物膜，可产生蛋白酶、纤维素酶及硝酸还原酶等生防相关酶类降解病原真菌细胞壁从而抑制病原菌生长，这与马佳等［19］研究解淀粉芽胞杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）B501 抑菌机制的结果相符。枯草芽胞杆菌L249 生长曲线结果表明，该菌延滞期短，4 h 就进入对数生长期，14 h 便达到最大生物量。菌株发酵时间短、生物量大及活力强，可节约生产成本，为今后工业化应用提供了理论依据。

本研究中测定了烟草赤星病的室内盆栽防效，结果发现，菌株L249 发酵液处理烟叶后，可显著降低烟草赤星病的病情指数，相对防效达60.66%，与罗楚翔等［20］和叶爱萍等［21］研究枯草芽胞杆菌对烟草赤星病的室内防效相比存在一定差异，推测这可能与供试枯草芽胞杆菌来源不同有关。除对烟草赤星病有较好防治效果外，枯草芽胞杆菌对其他植物病害也有良好防治效果［22-23］。本试验仅用枯草芽胞杆菌L249 对烟草赤星病进行室内防效测定，该菌对其他植物病害是否也具有较好的防治效果还有待进一步验证。

4 结论

从贵州省清镇市卫城镇烟区健康烟草根际土壤中分离到一株对链格孢菌有明显拮抗作用的菌株L249，经鉴定为枯草芽胞杆菌。该菌能有效抑制链格孢菌菌丝生长并造成菌丝膨大畸形，且对高粱叶点霉菌、大斑突脐蠕孢菌、烟草炭疽菌及尖孢镰孢菌等4种病原真菌也有一定抑制作用。该菌生长速度快，培养14 h可达到最大生长量。菌株L249能产生形态结构复杂的生物膜，能产蛋白酶、纤维素酶及硝酸还原酶等生防相关酶类，盆栽试验表明其发酵液可有效降低烟草赤星病的病情指数。