雪茄烟叶工业发酵过程中细菌群落多样性和结构变化

黄 阔，李 栋，王 彬，余 君，刘克建，李青常，米 强，孟庆华，范 黎，叶长文*

1.中国烟草总公司郑州烟草研究院，郑州高新技术产业开发区枫杨街2 号 450001

2.山东中烟工业有限责任公司，济南市历下区经十路11888 号 250014

3.湖北省烟草科学研究院，武汉市硚口区宝丰路6 号 430030

雪茄烟作为一种特殊的烟草制品，近年来销量不断增加，已逐渐成为烟草行业新的经济增长点和重点发展领域［1-3］。雪茄烟叶品质不仅受品种、栽培、晾制、农业发酵等关键技术的影响，而且受工业发酵环节的影响［4-5］。工业发酵能提高雪茄烟叶品质、彰显雪茄风格特色，是改善雪茄烟叶外观品质、物理特性、内在成分、吸食品质的关键［5］。而在烟叶发酵过程中，微生物在其中扮演着重要的角色［6-7］。雪茄烟叶的叶面微生物细菌群落组成丰富，发酵前细菌数量占绝对优势，群落结构随发酵进程而变化，细菌群落在发酵过程中发挥着重要作用［8-9］。因此，探究雪茄烟叶发酵过程中微生物群落多样性和结构变化规律，对于解析微生物在发酵过程中的作用，筛选功能微生物，优化发酵工艺，提升雪茄烟叶品质具有重要意义。目前，国内外关于雪茄烟叶工业发酵的研究主要集中在发酵条件、发酵工艺和发酵介质等方面。李晶晶等［10］通过探究不同发酵条件对雪茄烟叶中TSNAs 及其前体物含量变化的影响，发现不同发酵条件下的雪茄烟叶样品中TSNAs含量存在极显著差异，且TSNAs含量随发酵湿度增加而下降，生物碱与硝酸盐含量均随发酵湿度的增加而提高。叶惠源等［11］试验表明，工业发酵是雪茄烟叶品质提高的重要过程，定向选择微生物、酶及辅料类的外源添加物等发酵介质，并辅以配套的发酵工艺，可实现对雪茄烟叶品质和风味特征的定向调控。以上研究仅涉及发酵对雪茄烟叶品质的影响，而有关发酵条件的改变或外源发酵介质的添加对雪茄烟叶自身微生物群落，以及对于雪茄烟叶工业发酵过程中细菌群落多样性和结构变化规律的研究则鲜见报道。为此，以国产雪茄烟工业发酵过程中茄芯烟叶为研究对象，在混配发酵环节的堆积发酵过程中，研究雪茄烟叶工业发酵过程中细菌群落多样性和结构变化的规律，旨在明确微生物在工业发酵过程中的作用机理，为筛选优势功能微生物菌株提供依据。

1 材料与方法

1.1 样品采集

选择10 种不同类型雪茄烟叶原料（表1）进行工业发酵，发酵形式为堆积发酵。具体发酵步骤：首先，按照产品配方比例及数量要求，将所需10 种雪茄烟叶原料进行混配掺兑均匀。然后，按照茄芯加料配方配置料液并均匀添加，使加料后茄芯烟叶含水率控制在30%±2%范围内。再将加料后的茄芯烟叶置于发酵房（温度45 ℃±2 ℃，相对湿度83%±2%）中进行堆积发酵，发酵时间3 d，发酵过程中每天早晚各通风换气30 min，翻堆1次。

表1 雪茄烟叶的基本信息Tab.1 Basic information of cigar tobacco

分别在茄芯混配发酵前（HPFJQ）、混配发酵中（HPFJZ）和混配发酵后（HPFJH）3 个阶段，采集雪茄烟叶样品，每个环节3个样品，样品编号及取样时间见表2。使用无菌采样袋，对3 个阶段烟叶样品无菌取样，每个阶段的烟叶各随机选取250 g，迅速带回实验室于-18 ℃冰箱中低温冷冻保存。

表2 雪茄烟叶样品信息Tab.2 Information of cigar tobacco samples

1.2 样品DNA提取、PCR扩增与测序

于生物安全柜中使用无菌剪刀将叶片剪成约1 cm×1 cm 的小块，充分混合均匀后，3 个阶段样品各称取0.5 g，使用FastDNATMSPIN 试剂盒（美国MP Biomedicals 公司）提取总DNA。使用ThermoFisher Scientific（美国Multiskan GO 公司）酶标仪测量基因组DNA浓度和纯度。

上游引物为515F（5'-GTGCCAGCMGCCGC GGTAA-3'），下游引物为806R（5'-GGACTACHV GGGTWTCTAAT-3'）。PCR 反应总体积为20 μL，包括5×FastPfu 缓冲液4 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2 μL，5 μmol/L上、下游引物各0.8 μL，FastPfu 聚合酶0.4 μ L，牛血清蛋白（BSA）0.2 μL，20 ng/μL 模板DNA 1 μ L，ddH2O 补足至20µL。PCR 反应程序：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共27 个循环；最后72 ℃延伸10 min。使用质量分数为2%的琼脂糖凝胶电泳，检测PCR 产物。委托上海美吉生物医药科技有限公司进行Illumina MiSeq高通量测序。

1.3 数据处理

对原始数据进行拼接和过滤，以获得有效数据并确保结果的准确性和可靠性。使用QIIME（Quantitative Insights Into Microbial Ecology）v1.7.0（Caporaso 2010）对原始Illumina fastq 文件进行数据读取、质量过滤和比对分析。对操作分类单位（OTU）选择具有97%成对同一性的阈值。

用t检验（P<0.05）分析样本中的差异物种，找到显著的微生物群（平均相对丰度>1%）。对于线性判别分析（LDA）效应大小（LEfSe），采用Kruskal-Wallis 秩和检验（α=0.05）来识别类别之间具有显著差异丰度的分类群，然后使用LDA值估计每个差异丰富特征的效应大小（对数LDA 得分>2.0）。采用Microsoft Excel 2010 进行数据整理，用Origin 9.0 制图，测序数据在上海美吉生物医药科技公司I-Sanger 生物信息分析云平台（https：//cloud.majorbio.com/）进行处理。

2 结果与分析

2.1 发酵过程中细菌群落α多样性分析

基于OTU水平的发酵过程中细菌群落α多样性指数如图1 所示。随着发酵时间的推进，Sobs 指数和Chao 指数先降低后增高，表明与混配发酵前相比，混配发酵完成后的细菌群落物种丰富度低于发酵前水平。Shannon 指数先降低，后增高；Simpson指数先增高后降低，表明与混配发酵前相比，混配发酵完成后的细菌群落多样性高于发酵前水平。测序样本的Coverage 指数均在97%以上，说明测序结果可较好反映所测样本中细菌微生物情况。

图1 发酵过程中细菌群落多样性的变化Fig.1 Variation in bacterial community diversity during fermentation

2.2 发酵过程中细菌群落OTU聚类分析

在97%的相似度水平条件下，对各样品中所测得的OTU 序列进行聚类分析，3 个样品中共鉴定出5 个门，6 个纲，19 个目，35 个科，64 个属，96 个种，118 个OTUs。各样品中细菌群落分布见表3。随着发酵时间的推进，OTU 数量呈减少趋势，物种数量呈先减少，后增多趋势，发酵前期群落变化更剧烈。

表3 不同分类水平的细菌群落数量Tab.3 Number of bacterial communities at different classification levels （个）

图2 为各样品在OTU 水平上的Venn 图。混配发酵前期的OTU 数量最多，3 个阶段共有的OTUs占30 种，混配发酵前与混配发酵中共有的OTUs 占47 种，混配发酵前与混配发酵后共有的OTUs 占51种，混配发酵中与混配发酵后共有的OTUs占37种。

图2 雪茄烟叶发酵过程中细菌群落Venn图Fig.2 Venn diagram of bacterial communities during cigar tobacco fermentation

2.3 发酵过程中细菌群落结构变化分析

在门水平上，共检出5 个门类的细菌（图3），厚壁菌门（Firmicutes）在混配发酵前、混配发酵中和混配发酵后样本中的平均相对丰度分别为62.29%、72.81%和49.14%。在混配发酵前占比最高，随着发酵时间的推进，平均相对丰度先增加后减少。变形菌门（Proteobacteria）在混配发酵前、混配发酵中和混配发酵后样本中的平均相对丰度分别为30.31%、17.80%和49.14%。在混配发酵后占比最高，随着发酵时间的推进，平均相对丰度先减少后增加。放线菌门（Actinobacteriota）在混配发酵前、混配发酵中和混配发酵后样本中的平均相对丰度分别为7.00%、9.26%和9.85%，混配发酵后占比最高。拟杆菌门（Bacteroidota）在混配发酵前、混配发酵中和混配发酵后样本中的平均相对丰度分别为0.41%、0.09%和14.27%，混配发酵后其比例明显提升，表明发酵完成后占比明显增多。疣微菌门（Verrucomicrobiota）在各样品中占比极低，平均相对丰度均低于0.01%。

图3 雪茄烟叶发酵过程中门水平细菌群落平均相对丰度Fig.3 Average relative abundances of bacterial communities at phylum level during cigar tobacco fermentation

在属水平上，各样本中细菌群落的基本组成如图4所示。混配发酵过程中在属水平上物种种类从47 种减少到39 种，最终在平均相对丰度大于1%的类群中，随着发酵时间的推进，数量从24 种减少到17种，最终增加到20种。表明发酵完成后各细菌类群的平均相对丰度之间差异减小，群落多样性提高。

图4 雪茄烟叶发酵过程中属水平的细菌群落平均相对丰度Fig.4 Average relative abundances of bacterial communities at genus level during cigar tobacco fermentation

在属水平上，平均相对丰度大于1%的菌群在各样本间的物种聚类分析结果如图5 所示。混配发酵前，海洋芽胞杆菌属（Oceanobacillus）（31.93%）、丛毛单胞菌属（Comamonas）（10.34%）、芽胞杆菌属（Bacillus）（7.27%）为优势菌属；混配发酵中，海洋芽胞杆菌属（Oceanobacillus）（40.02%）、Terribacillus（13.23%）、克雷伯氏菌属（Klebsiella）（9.62%）为优势菌属；混配发酵后，丛毛单胞菌属（Comamonas）（12.01%）、鞘氨醇杆菌属（Sphingobacterium）（14.23%）、Georgenia（9.67%）、类芽胞杆菌属（Paenibacillus）（8.72%）为优势菌属。聚类分析结果表明，混配发酵前与混配发酵中各样本间物种组成有交叉，且聚为一类，但混配发酵完成后物种组成发生明显改变，优势菌属变化较大，各样本间重复性较好。

图5 雪茄烟叶发酵过程中属水平细菌群落热图Fig.5 Heatmap for bacterial communities at genus level during cigar tobacco fermentation

2.4 发酵过程中细菌群落结构差异分析

在属水平上，将平均相对丰度大于1%的菌群进行多组比较分析，图6 仅列出混配发酵过程中具有显著性差异的菌群，共有17种菌属差异显著。随着发酵过程的进行，有10种菌属平均相对丰度显著增加，分别是鞘氨醇杆菌属（Sphingobacterium）、Georgenia、类芽胞杆菌属（Paenibacillus）、细粒类极小单胞菌属（Parapusillimonas）、假单胞菌属（Pseudomonas）、DSSF69、溶杆菌属（Lysobacter）、假黄色单胞菌属（Pseudoxanthomonas）、短芽胞杆菌属（Brevibacillus）、极小单胞菌属（Pusillimonas）；有7 种菌属显著降低，分别是Terribacillus、克雷伯氏菌属（Klebsiella）、Atopococcus、棒杆菌属（Corynebacterium）、unclassified_f_Carnobacteriaceae、Aerococcus和Atopostipes。

图6 属水平样本的组间差异显著性分析Fig.6 Difference significance test between samples at genus level

3 讨论

本研究中发现雪茄烟叶工业发酵过程中，发酵完成时物种丰富度低于发酵前水平，物种多样性高于发酵前水平，OTU 数量随混配发酵时间的延长而降低，且发酵前期变化更为剧烈。这与张鸽等［9］的研究结果基本一致。相关研究也表明，发酵是雪茄烟叶调制后独特的加工环节，微生物菌群结构变化较为剧烈［12］，发酵前烟叶带菌量一般较高，细菌数量占绝对优势，但随发酵进程的推进，烟叶带菌量不断减少，发酵完成时烟叶带菌量显著降低［8，13］。

雪茄烟叶工业发酵过程中细菌微生物群落的演替规律表明，优势菌门由发酵前期的厚壁菌门（Firmicutes）转变为发酵后期的变形菌门（Proteobacteria）。混配发酵前期，海洋芽胞杆菌属（Oceanobacillus）、丛毛单胞菌属（Comamonas）、芽胞杆菌属（Bacillus）为优势菌属；混配发酵中期，海洋芽胞杆菌属（Oceanobacillus）、Terribacillus、克雷伯氏菌属（Klebsiella）为优势菌属；混配发酵后期，丛毛单胞菌属（Comamonas）、鞘氨醇杆菌属（Sphingobacterium）、Georgenia、类芽胞杆菌属（Paenibacillus）为优势菌属。本研究中也发现发酵前后细菌的优势菌属发生较大变化，发酵完成后各细菌类群的平均相对丰度之间差异减小，群落多样性提高，且优势菌属逐渐发生转变。由于雪茄烟叶原料来源的差异性等原因，叶面细菌优势菌群可能存在差异，但相关研究也表明雪茄烟叶发酵有助于提高群落多样性［4，12，14］，且优势菌属逐渐向更有潜在应用价值的功能性微生物发生转变［10，15-16］。

随着混配发酵过程的推进，有17 种菌属变化显著。其中，10 种菌群平均相对丰度显著增加：鞘氨醇杆菌属（Sphingobacterium）、Georgenia、类芽胞杆菌属（Paenibacillus）、细粒类极小单胞菌属（Parapusillimonas）、假单胞菌属（Pseudomonas）、DSSF69、溶杆菌属（Lysobacter）、假黄色单胞菌属（Pseudoxanthomonas）、短芽胞杆菌属（Brevibacillus）和极小单胞菌属（Pusillimonas）；7 种菌群平均相对丰度显著降低：Terribacillus、克雷伯氏菌属（Klebsiella）、Atopococcus、棒杆菌属（Corynebacterium）、unclassified_f_Carnobacteriaceae、Aerococcus和Atopostipes。表明雪茄烟叶工业发酵过程中，细菌菌群结构发生明显改变。对发酵过程中显著变化的菌群和优势菌属比较发现，鞘氨醇杆菌属（Sphingobacterium）、Georgenia和类芽胞杆菌属（Paenibacillus）作为混配发酵完成后的优势菌属，平均相对丰度显著增加，说明在雪茄烟叶工业发酵过程中可能发挥着重要的功能作用，而其与雪茄烟叶品质的关系，以及作为功能微生物进行外源添加的可行性尚有待进一步研究。

4 结论

雪茄烟叶工业发酵过程中细菌群落的物种丰富度降低，多样性提高，OTU 数量持续降低。优势菌门由发酵前期的厚壁菌门向发酵后期的变形菌门转变；优势菌属由海洋芽胞杆菌属、丛毛单胞菌属、芽胞杆菌属向丛毛单胞菌属、鞘氨醇杆菌属、Georgenia、类芽胞杆菌属转变。鞘氨醇杆菌属、Georgenia和类芽胞杆菌属为混配发酵完成后平均相对丰度显著增加的优势菌群，可能在雪茄烟叶发酵过程中发挥着重要的功能作用。