电子烟烟液中烟碱异构体的分离及感官差异

朱瑞芝，王 凯，蒋 薇，杨 继，司晓喜，刘志华，徐艳群，向能军，何 沛

云南省烟草化学重点实验室，云南中烟工业有限责任公司技术中心，昆明市五华区红锦路367号 650231

电子烟为将电子烟烟液转化为可吸入气溶胶的系统［1］，通过气溶胶向消费者递送一定量的烟碱，从而使消费者获得类似吸烟的感官感受［2-3］。烟碱是电子烟烟液的重要成分，大多数商业化的烟碱均由烟草企业的副产品提取纯化而来［4-5］。烟碱分子含有一个手性中心，有两个代谢机理和生理特性完全不同的异构体［6-8］：S-(-)-烟碱和R-(+)-烟碱。来源于烟草的烟碱主要以S-(-)-烟碱构型存在，且其占烟碱总量的99%以上［9］。但近年来，随着非烟草烟碱（Tobacco free nicotine,TFN）在电子烟等新型烟草制品中的应用，烟碱异构体越来越受到人们的关注［10］。文献［11］报道对电子烟烟液中烟碱的手性分离分析方法主要有手性色谱柱-正相液相色谱-二极管阵列检测器分析法。正相色谱体系受试剂和环境中水分影响较大，会导致色谱峰保留时间不稳定；同时由于实验室常用反相液相色谱法，在仪器使用过程中反相色谱和正相色谱之间溶剂体系切换所需时间长，而且对仪器稳定性影响较大，不利于实验室多种方法的使用和仪器维护。基于此，本研究中开发了手性色谱柱-反相液相色谱-二极管阵列检测器分析法，对电子烟烟液样品中的烟碱异构体进行分离分析，同时对2种烟碱异构体及消旋体烟碱的感官差异进行研究，旨在为电子烟的研发和管理提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂和仪器

20种不同烟碱质量分数的电子烟烟液样品（市售）。

甲醇、乙腈（HPLC级，德国Merck公司）；三乙胺、甲酸铵（AR，南京化学试剂股份有限公司）;乙酸（AR，国药集团化学试剂有限公司）；乙酸铵、二乙胺（AR，廊坊鹏彩精细化工有限公司）；(R，S)-烟碱标准品、S-(-)-烟碱和R-(+)-烟碱标准品（＞99%，加拿大TRC公司）。

可填充式电子烟（功率7~10 W，云南中烟工业有限责任公司技术中心提供）；Agilent1290液相色谱仪（美国Agilent公司）；Milli-Q-Intergral 5超纯水仪（美国Millipore公司）；SHZ-88水浴恒温振荡器（金坛市医疗仪器厂）；BT125D电子天平（感量0.000 1 g，德国Sartorius科学仪器有限公司)；KQ-700DB数控超声波清洗仪（昆山市超声仪器有限公司）；有机相滤膜（0.22µm，上海楚定分析仪器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 样品前处理及分析

准确称取0.2 g电子烟烟液样品，精确至0.000 1 g，置于50 mL离心管中，加入20 mL甲醇溶液，密闭，放入超声波水浴中，于常温下超声萃取20 min，过滤后进行液相色谱分析。仪器条件：

检测波长：259 nm；柱温箱：25℃；进样量：3 μL；色谱柱：Agilent InfinityLab Poroshell Chiral-T柱（150 mm×4.6 mm，2.7µm）；流动相：V甲醇∶V乙腈=45∶55（甲醇为混合液：V甲醇∶V乙酸∶V三乙胺=100∶0.25∶0.05）；流速：1 mL/min，等度洗脱。

1.2.2 数据处理

采用Origin柱状图分析萃取溶剂体积对电子烟烟液中2种烟碱异构体提取效果的影响；采用Agilent OpenLAB数据分析软件绘制标准工作曲线，获取回归方程和相关系数。

2 结果与讨论

2.1 手性色谱柱的选择

为了实现2种烟碱异构体在反相体系中的手性分离，考察了不同色谱柱及分离模式对烟碱异构体的分离效果，选择与反相色谱流动相匹配的手性柱及其色谱条件，并优化了流动相的比例、添加剂的种类及浓度。考察的手性色谱柱包括Agilent公司的Chiral-T、Chiral-CD柱以及DAICEL公司的IA-3、IC-3柱共4种，在反相色谱模式（Reverse Phase Chromatography，RP）及优化的色谱条件下，发现Agilent Chiral-T柱对2种烟碱异构体的分离度较好（图1）。因此，本实验中采用Agilent Chiral-T柱进行后续的烟碱异构体分离。

图1 不同手性柱对烟碱异构体的分离效果Fig.1 Separation of nicotine isomers by different chiral columns

2.2 流动相添加剂的优化

由于烟碱是二元弱碱，在水溶液中以游离态、单质子态和双质子态等多种形态存在，用流动相洗脱时容易出现烟碱峰拖尾的现象［12］。在本研究中，考察了流动相的酸碱比例对分离效果的影响。添加剂分别选用乙酸、甲酸、二乙胺、三乙胺和乙酸铵，发现三乙胺的分离效果最好，乙酸次之，二乙胺和乙酸铵均表现较差。采用乙酸-三乙胺的缓冲体系可稳定流动相的pH，从而使烟碱以合适的状态存在，有利于色谱峰分离。在流动相中添加一定比例的乙酸和三乙胺，具有重现性好以及准确度和灵敏度高的特点，达到了改善峰宽和减少色谱峰拖尾的效果，2种烟碱异构体的分离度达到1.9以上，如图2所示。采用优化的方法对实际样品进行分离分析，色谱图见图3。可知，实际样品中2种烟碱异构体的分离度良好，满足实验需求。

图2 外消旋烟碱标准溶液的色谱图Fig.2 Chromatogram of standard solution for racemic nicotine

图3 典型电子烟烟液样品的色谱图Fig.3 Chromatogram of a typical e-liquid sample

2.3 萃取溶剂的选择

目前，文献报道的对电子烟烟液中烟碱的萃取溶剂主要是甲醇和异丙醇［11,13-14］，考虑到文献报道方法与本方法在仪器方法和溶剂体系上均存在差异，因此比较了甲醇和异丙醇作为萃取剂在本方法中的适用性，结果如图4所示。可见，以甲醇为萃取溶液，溶剂本底低，峰形好，峰面积稍大于异丙醇。由于本方法中采用甲醇为洗脱相，综合考虑后，选择甲醇为萃取溶剂。

图4 不同溶剂对电子烟烟液中2种烟碱异构体萃取效果的影响Fig.4 Effects of different solvents on extraction efficiencies of two nicotine isomers in e-liquids

2.4 萃取体积的选择

在固定称样量的情况下，考察了不同萃取剂体积对电子烟烟液中2种烟碱旋光异构体萃取效果的影响，结果如图5所示。可知，分别采用10、15、20、25、30 mL甲醇萃取电子烟烟液中的2种烟碱异构体，当萃取溶液为20 mL时所测得的2种烟碱异构体的质量分数均达到最大值。因此，采用20 mL甲醇进行电子烟烟液中2种烟碱异构体的萃取。

图5 萃取溶剂体积对电子烟烟液中2种烟碱异构体萃取效果的影响Fig.5 Effects of extraction volume on extraction efficiencies of two nicotine isomers in e-liquids

2.5 标准工作曲线及检测限

根据目标物的检测浓度和灵敏性，对配制好的系列标准工作溶液进行检测，以分析物的浓度为横坐标，S-(-)-烟碱和R-(+)-烟碱的峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线，获取回归方程和相关系数，决定系数(R2)应不小于0.99。对每个物质的最低浓度对应的标准溶液平行测定10次，分别以所得测定结果标准偏差的3倍和10倍为方法的检出限(LODs)和定量限(LOQs)，相关结果如表1所示。可知，S-(-)-烟碱和R-(+)-烟碱分别在25~500、0.25~10.00μg/mL浓度范围内，线性关系良好，R2分别为0.999 6和0.999 4；2种烟碱异构体的检出限均为0.008 mg/g，定量限均为0.027 mg/g。

表1 方法的线性范围、回归方程、决定系数、检出限和定量限Tab.1 Linear concentration ranges,regression equations,linear correlation coefficients(R2),LODs and LOQs of the method

2.6 精密度和回收率

选取已知浓度的电子烟烟液样品，考察方法的精密度和回收率。对样品进行5次日内和日间平行测定，考察方法的精密度。结果（表2）表明，本方法S-(-)-烟碱的日内、日间RSD分别为0.89%、1.26%，R-(+)-烟碱的日内、日间RSD分别为3.98%、4.70%。按高、中、低3个加标水平对已知浓度的电子烟烟液样品进行回收率实验，结果见表3。可知，S-(-)-烟碱的回收率在95.87%~104.22%之间，R-(+)-烟碱的回收率在102.43%~108.85%之间。可见，本方法的精密度好，回收率高，表明方法稳定可靠，可用于电子烟烟液中烟碱异构体质量分数的测定。

表2 方法的日内及日间精密度Tab.2 Intra-and inter-day precisions of the method （mg·g-1）

表3 方法的加标回收率Tab.3 Spiked recoveries of the method （%）

2.7 样品分析

对市售20种不同口味、不同烟碱质量分数的电子烟烟液样品中烟碱异构体的分析结果见表4。可知，电子烟烟液中烟碱主要为S-(-)-烟碱，其质量分数范围在2.325～22.042 mg/g之间，而R-(+)-烟碱的量极少，在0.030～0.273 mg/g之间；S-(-)-烟碱的光学纯度在96.74%~100.00%之间。在收集的20种电子烟烟液中，未发现外消旋烟碱的使用，可见由于国内对烟碱来源的管控，国内市场上所销售的电子烟烟液中的烟碱，主要来源于烟草提取物。本研究结果也可为电子烟烟液中烟碱来源的管控提供一种便捷的方法。

表4 电子烟烟液样品测试结果Tab.4 Test results of the e-liquid samples

2.8 烟碱异构体感官评价结果

据 报 道［15］，非 烟 草 烟 碱（TFN），由Next Generations实验室合成，Pharmanic公司注册商标，并在几家公司的电子烟烟液产品中得到应用。因此烟碱异构体在新型烟草制品中的可用性受到关注［10］。本实验中对含不同浓度梯度的S-(-)-烟碱、R-(+)-烟碱以及(R，S)-烟碱的电子烟烟液感官差异性进行了评价。以V甘油∶V丙二醇=1∶1为基液，分别将不同烟碱异构体样品配制成不同浓度的溶液，注入电子烟储液器中进行感官评吸，评吸结果见表5。结果表明：S-(-)-烟碱、R-(+)-烟碱2种异构体及(R，S)-烟碱消旋体，在劲头、满足感、刺激性3项指标上的趋势一致，均为S-(-)-烟碱＞(R，S)-烟碱＞R-(+)-烟碱，即S-(-)-烟碱的劲头最高，满足感最强，刺激性最大。

表5 烟碱异构体的感官评吸得分结果Tab.5 Scores of sensory evaluation of nicotine isomers

3 结论

①建立了稳定便捷的手性色谱柱-反相液相色谱-二极管阵列检测器分离分析电子烟烟液中的S-(-)-烟碱和R-(+)-烟碱异构体的方法；②对20种市售电子烟烟液样品中烟碱异构体的分析结果表明，电子烟烟液中烟碱主要为S-(-)-烟碱，其质量分数范围在2.325～22.042 mg/g之间，S-(-)-烟碱的光学纯度在96.74%~100.00%之间，未发现外消旋烟碱的使用；③对烟碱异构体感官差异性评价结果表明：S-(-)-烟碱的劲头最高，满足感最强，刺激性也最大；R-(+)-烟碱的劲头最小，满足感最低，刺激性也最小；(R，S)-烟碱的劲头、满足感和刺激性均介于S-(-)-烟碱和R-(+)-烟碱之间。