烟草ACS 基因家族鉴定及二氯喹啉酸胁迫条件下的表达分析

潘 婷，李泽锋，陈 凯，王 中，杨小年，朱丽颖，汪耀富，蒲文宣，曹培健，杨 军，罗朝鹏*

1. 中国烟草总公司郑州烟草研究院，郑州高新技术产业开发区枫杨街2 号 450001

2. 湖南中烟工业有限责任公司技术中心，长沙市雨花区劳动中路386 号 410007

二氯喹啉酸属于生长素类除草剂，主要用于防除稗草和阔叶类杂草，是我国稻田中常用的除草剂，年施用面积占稻作区面积的25%［1］。由于长期大量使用，近年来湖南、广东和江西等烟稻轮作区烟草上陆续发生二氯喹啉酸药害，给烟叶生产造成较大损失［2-3］。烟草二氯喹啉酸药害产生的原因是前茬水稻使用二氯喹啉酸，造成土壤残留，导致在后茬作物烟草上发生药害。烟草二氯喹啉酸药害已经成为影响我国烟叶安全生产的主要问题。

作为一种生长素类除草剂，其作用机制与生长素信号转导以及泛素/26S蛋白酶体途径密切相关［4］，涉及生长素受体（Transport inhibitor response 1，TIR1/Auxin signaling f-box，AFB；TIR1/AFB）、共受体 Aux/IAA（Auxin/indole acetic acid）、SCF 型 E3 泛素化连接酶（S-PHASE Kinase associated protein 1-Cullin1-F-Box（SCF）-type E3 ligase）、生长素响应因子（Auxin response factor，ARF）和生长素反应基因等。其中SCF 型E3 泛素化连接酶是泛素/26S 蛋白酶体途径的主要催化酶，TIR1/AFB和Aux/IAA是SCF 型E3 泛素化连接酶的组分。Aux/IAA 除了作为共受体外，还是ARF 的抑制子。ARF 是一类转录因子，能够特异地与生长素响应基因启动子区域的生长素响应元件（Auxin response element，AuxRE）结合，激活或抑制生长素响应基因的表达［5］。生长素类除草剂的主要作用机制是：除草剂首先与TIR1/AFB 和Aux/IAA 结合，启动生长素信号转导，形成SCFTIR1/AFB-Aux/IAA-生长素复合体，进入泛素/26S蛋白酶体途径，导致Aux/IAA发生泛素化降解，并解除Aux/IAA 对ARF 的抑制，进而激活生长素响应基因的表达［6-8］。生长素响应基因包括ACS和9-顺式-环氧类胡萝卜素双加氧酶基因（9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase，NCED）等［9］。

ACS 是乙烯合成的关键酶，可催化形成乙烯前体1-氨基环丙烷-1-羧酸（1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid，ACC）。研究发现，二氯喹啉酸通过诱导ACS 过量表达而产生大量乙烯，导致植物生长受阻甚至死亡，可能是生长素类除草剂防治杂草的作用机制［10］。二氯喹啉酸也用于防治禾本科杂草马唐，但由于长期大量使用，马唐已产生了抗药性。使用二氯喹啉酸处理马唐，敏感株系中乙烯含量提高3 倍，而抗性株系中的乙烯含量没有显著变化。使用ACS 抑制剂进行预处理，能使敏感株系在药害发生时乙烯含量下降89%，药害症状程度减轻37%［11］。在稗草中也得到相似的研究结果［12］。说明植物发生药害时可通过降低自身乙烯含量，而减轻药害症状，降低药害损失。目前已经完成ACS 基因家族鉴定的植物有拟南芥［13］、黄瓜［14］和苹果［15］等，而烟草ACS 基因家族的系统鉴定与分析尚未见报道。为此，对普通烟草品种红花大金元ACS 基因家族进行了鉴定，并对这些基因在二氯喹啉酸胁迫条件下的表达模式进行了分析，以明确烟草二氯喹啉酸药害的发生机制。

1 材料与方法

1.1 材料

以5 叶期普通烟草品种K326 为材料，每株烟浇灌20 mL 浓度0.2 mg/kg 的二氯喹啉酸溶液（75%可湿性粉剂，成都科利隆生化有限公司），采集浇灌处理后2 h、6 h、1 d、7 d和14 d的烟草叶片和根组织，对照（以0 h 表示）浇灌同等体积的清水。每个时间点取3株，每株为1次生物学重复。

1.2 方法

使用拟南芥ACS家族蛋白序列在烟草和番茄基因组数据库（https：//www.sgn.cornell.edu/）中进行比对（BLASTP，E值＜100），将获得的序列进行家族保守结构域分析（PFAM：PF00155.18），鉴定普通烟草、林烟草、绒毛状烟草和番茄ACS 蛋白。利用在线软件Compute pI/Mw（http：//www.expasy.ch/tools/pi_tool.html）进行烟草蛋白质分子量和等电点预测。使用WoLF PSORT 软 件 （https：//www.genscript.com/wolf-psort.html）进行亚细胞定位预测。利用MEGAX软件进行多序列比对（MUSCLE法）和系统进化树构建（邻接法，bootstrap设置为1 000）。使用Genedoc软件进行氨基酸序列比对和编辑。顺式作用元件预测使 用 PlantCARE 数 据 库（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/），启动子长度选择起始密码子上游2 000 bp。

所用引物见表 1。 内参引物为 26s-F：5′-GAAGAAGGTCCCAAGGGTTC-3′，26s-R：5′-T CTCCCTTTAACACCAACGG-3′。引物由北京六合华大基因科技有限公司合成。第一链cDNA合成以Oligo（dT）为引物，使用AMV（Takara，宝生物工程大连有限公司）进行合成。定量PCR 使用2×SYBR Green qPCR Mix 试剂（KEMIX，北京密码子生物科技有限公司），所用仪器为Bio-rad CFX96。根据Livak等［16］的方法进行相对表达量分析。

表1 引物信息Tab.1 Information of primers

2 结果与分析

2.1 烟草ACS家族鉴定及基本特征分析

根据拟南芥ACS 家族蛋白序列，分别鉴定普通烟草、林烟草、绒毛状烟草和番茄ACS 家族蛋白。普通烟草有26 个ACS 基因（表2），林烟草12 个，绒毛状烟草 11 个，番茄 14 个。23 个普通烟草 ACS 基因定位在染色体上，9 号染色体上的ACS 基因最多，有 3 个；3 个基因定位在 scaffold 上。ACS 基因外显子数3～4 个。CDS 长度为1 002～1 476 bp，编码的蛋白最长含有491 aa，最短含有333 aa。分子量37.49～55.31 kDa，等电点5.29～8.62。核苷酸序列同源性为35.3%～99.9%，氨基酸一致性为27.5%～100% 。Ntab0327960、Ntab0675660、Ntab0907580、Ntab0292120 和 Ntab0756340 等 5 个蛋白的不稳定系数小于40，属稳定蛋白质，其余均为不稳定蛋白。蛋白总平均亲水性均为负值，因此烟草ACS 全部为亲水性蛋白。亚细胞定位预测表明，烟草ACS蛋白主要定位在细胞核或者细胞质中。

表2 烟草ACS家族的基本特征Tab.2 Essential characteristics of tobacco ACS family

2.2 系统进化分析

采用来源于普通烟草、林烟草、绒毛状烟草、番茄和拟南芥5个物种共72条ACS的蛋白序列构建系统进化树，结果见图1。图1 中显示，ACS 家族进化形成3类，分别为Ⅰ类、Ⅱ类和Ⅲ类。其中Ⅲ类成员最少，普通烟草有5个成员。Ⅰ类成员最多，普通烟草有13个成员。相比较而言，拟南芥在Ⅱ类中成员最多（5个），在Ⅰ类中次之（3个），在Ⅲ类中只有1个成员。

图1 烟草ACS家族的系统进化分析Fig.1 Phylogenetic analysis of tobacco ACS family

2.3 氨基酸序列分析

ACS属于以磷酸吡哆醛（PLP）为辅酶的酶家族，酶活性中心位于保守区域［17］。ACS 家族成员含有7个保守氨基酸基序（BOX1～BOX7）和11个保守氨基酸位点（以▼和*标示）。从氨基酸序列比对结果（图2）中发现，所有烟草ACS 均含有保守位点E（BOX1中的·），该位点决定了ACS 催化反应的特异性［18］。BOX2中的Y位点与ACS的底物识别相关［19］，烟草有3 个 ACS 缺 少 该 位 点 ，分 别 是 Ntab0870430、Ntab0187580和Ntab0187590。

图2 ACS氨基酸序列比对Fig.2 Amino acid sequence alignment of ACS

ACS 蛋白 C 端序列包含 1 个保守的丝氨酸（S）位点，该位点能够被CDPK 磷酸化。还包含3 个MAPK磷酸化位点。根据ACS蛋白序列比对结果，I类成员C 端氨基酸序列较长，除Ntab0187580 外，均含有CDPK和MAPK磷酸化位点。Ⅲ类成员C端最短，没有CDPK 和MAPK 磷酸化位点。Ⅱ类成员除Ntab0759760 外，均含有CDPK 磷酸化位点和TOE基序。

2.4 启动子分析

启动子是基因表达调控的重要元件［14］。烟草ACS基因启动子区的激素相关顺式作用元件分析结果（图3）显示，烟草ACS基因启动子区含有脱落酸、茉莉酸、水杨酸、生长素和赤霉素5种激素反应共10种类型的顺式作用元件。其中赤霉素反应相关的顺式作用元件有3种，茉莉酸、水杨酸和生长素反应有2种，脱落酸有1种。绝大多数基因的启动子区都含有ABRE、CGTCA-motif和TGACG-motif 3种类型的顺式作用元件。在这3种类型元件中，ABRE的数量最多，特别是在Ntab0504530 和Ntab0060800 中含有7个ABRE元件。SARE与水杨酸反应相关，该元件只在Ntab0292120中发现。TGA-element和AuxRR-core是生长素反应元件，TGA-element在10个基因的启动子中均存在，其中Ntab0115830 含有4个TGA-element。表明烟草ACS基因表达可能受脱落酸、茉莉酸、水杨酸、生长素和赤霉素5种激素的调控。

图3 普通烟草ACS启动子激素相关顺式作用元件分析Fig.3 Analysis on hormone-related cis-acting elements of NtACS promoter

2.5 表达模式分析

相对表达量分析结果（图4）显示，烟草ACS 家族绝大多数成员受二氯喹啉酸诱导而上调表达。上调幅度较大的基因有Ntab0759760、Ntab0856230、Ntab0650880、Ntab0187590 和 Ntab0805630，分别上调 137、126、71、42 和 39 倍。相反，Ntab0504530 和Ntab0187580在叶片和根系中均下调表达。

图4 普通烟草ACS家族基因表达分析Fig.4 Expression analysis of NtACS gene family

大部分基因在叶片中的上调幅度较大，在根系中则相对较小。但Ntab0292120 和Ntab0650880、Ntab0003870、Ntab0474970 和 Ntab0060800 5 个基因则相反，在根系中上调幅度较大，在叶中较小。Ntab0883620、Ntab0907570 和 Ntab0675660 3 个基因只在叶片中上调表达，在根系中表达量变化不大。Ntab0474970在叶中和根系中的表达趋势相反，在叶片中上调表达了19 倍，在根系中却下调表达了10倍。

大部分基因在二氯喹啉酸溶液处理后24 h表达量最高，但Ntab0907570 和Ntab0675660 两个基因在处理后14 d 表达量最高，Ntab0504530 在处理后7 d表达量最高，Ntab0003870在处理后6 h表达量最高，Ntab0569080在处理后2 h表达量最高。

3 讨论

有研究发现，ACS 蛋白C 端是酶活性调控的主要区域。该区域长度差异较大。Ⅰ类成员C端序列最长，含有1个CDPK磷酸化位点和3个MAPK磷酸化位点。这些位点的磷酸化能够稳定ACS 蛋白活性，从而增加乙烯产生量［20-22］；而非磷酸化，会造成蛋白迅速被26S 蛋白酶体途径降解，从而降低乙烯产生量。Ⅲ类成员C 端长度最短，不含有任何已知的调控位点。Ⅱ类成员C端长度较长，含有1个TOE基序和1个CDPK磷酸化位点。TOE基序是E3连接酶的结合位点，E3连接酶的结合会促进Ⅱ类ACS蛋白的降解。TOE基序中含有1个CDPK磷酸化位点，该位点的磷酸化能够抑制26S 蛋白酶体与ACS 的C端结合，从而维持ACS 蛋白的稳定性并增加乙烯产生量；而非磷酸化会造成ACS 迅速被26S 蛋白酶体途径降解［23］。在 TOE 基序中，WVF 这 3 个氨基酸是E3 连接酶与ACS 结合所必需的。在烟草中，除WVF 形式外，还有 WGF、WVS 和 WVV 3 种突变形式，这些突变形式是否会影响TOE与E3连接酶的结合，进而影响ACS的稳定性和乙烯的产生量，还需要进一步试验验证。

生长素和乙烯之间存在相互作用，生长素能促进乙烯合成，乙烯也能促进生长素合成［24］。作为一种生长素类除草剂，二氯喹啉酸通过诱导ACS 过量表达而产生大量乙烯，从而导致杂草死亡，可能是二氯喹啉酸除草的作用机制之一［4］。本研究结果表明，在二氯喹啉酸处理后，大部分ACS 家族成员都上调表达，和杂草中的表达相似，推测烟草二氯喹啉酸药害跟除草的作用机制相似，都是通过诱导ACS 过量表达，造成乙烯大量积累，从而使烟草表现出药害症状。

二氯喹啉酸作为一种生长素类物质，其作用与生长素信号途径密切相关，而ARF 等生长素信号途径相关转录因子能够直接结合到生长素响应基因启动子区的生长素响应元件上，从而调控生长素响应基因的表达［5］。对烟草ACS启动子分析发现，至少有11个ACS含有生长素反应元件TGA-element，有4个含有元件AuxRR-core，说明ARF可能调控这些基因的表达。因此，推测二氯喹啉酸调控ACS表达，其过程是：二氯喹啉酸首先与生长素受体结合，通过生长素信号途径和泛素/26S 蛋白酶体途径，激活ARF。ARF 结合到ACS 启动子区的生长素反应元件上，启动这些基因大量表达，最终造成乙烯的过量积累。

4 结论

普通烟草红花大金元ACS家族有26个成员，全部为亲水性蛋白，主要定位于细胞核或者细胞质中，进化形成3 类。Ⅰ类成员含有CDPK 和MAPK 磷酸化位点，Ⅲ类成员不含有CDPK 和MAPK 磷酸化位点，Ⅱ类成员含有CDPK 磷酸化位点和TOE 基序。启动子区含有脱落酸、茉莉酸、水杨酸、生长素和赤霉素共5种激素反应的10种顺式作用元件。二氯喹啉酸能诱导大部分烟草ACS基因的上调表达。