八大香型风格新鲜烟叶代谢特征的生态成因分析

周会娜，刘萍萍，张玉霞，王宝林，郑庆霞，贾国涛，罗登山，姚 倩，乔学义，张俊岭*

1. 中国烟草总公司郑州烟草研究院，郑州高新技术产业开发区枫杨街2 号 450001

2. 河南中烟工业有限责任公司，郑州市榆林南路16 号 450000

代谢组学是对某生物或细胞在特定生理时期内所有代谢产物同时进行定性和定量分析的一门学科［1-2］。烟草代谢物是烟草品质构成的物质基础，其水平除受栽培品种影响外，还与土壤、海拔高度以及温度、日照时数、降雨量等气候条件相关［3］。连培康等［4］分析了贵州乌蒙烟区不同海拔烤烟碳氮代谢的差异，发现海拔高度影响乌蒙烟区烤烟碳氮代谢水平，中海拔地区烟叶细胞发育更为合理，碳氮代谢协调性更好，化学成分更加协调。金云峰［5］以烟草植株为材料，分析了温度对烟草植株生长发育、光合生理生化特性、质体色素代谢和多酚物质代谢的影响，发现高温和低温处理对烟草叶片的生长发育均有抑制作用，不同生长温度对不同生育期的烟碱含量及基因表达均有不同程度的影响。孟霖［6］研究了光质对烤烟叶片代谢物质积累及烟苗发育的影响，确定不同波段光谱烟叶成熟后期的辐射量与烟叶化学成分有较强的相关性，生物碱在不同光质处理间变化趋势一致，红光和黄光明显促进了生物碱积累。Li等［3］利用基于LC-MS/MS 的烟叶代谢谱分析方法，从全局表征烟叶代谢组，对津巴布韦和中国的烟叶进行了对比，并找出了主要的差异代谢物。耿召良等［7］研究了贵州不同产区烟叶，考察了生态条件和品种因素对烤烟次生代谢产物如生物碱、有机酸类、多酚类和甾醇类物质等含量的影响，结果表明，生态条件对烟叶次生代谢产物含量影响明显，而品种因素对烟叶次生代谢产物影响较小。对云南、贵州和河南3地烟叶中代谢物的分析结果也表明，地区差异是造成代谢物差异的主要因素，其重要性高于品种差异［8-11］。

根据“全国烤烟烟叶香型风格区划研究”项目的研究结果，按照香韵可将烤烟分为八大香型风格区，分别为：西南高原生态区（Ⅰ区，清甜香型）、黔桂山地生态区（Ⅱ区，蜜甜香型）、武陵秦巴生态区（Ⅲ区，醇甜香型）、黄淮平原生态区（Ⅳ区，焦甜焦香型）、南岭丘陵生态区（Ⅴ区，焦甜醇甜香型）、武夷丘陵生态区（Ⅵ区，清甜蜜甜香型）、沂蒙丘陵生态区（Ⅶ区，蜜甜焦香型）、东北平原生态区（Ⅷ区，木香蜜甜香型）。目前，根据八大香型风格区区划分析生态因素对鲜烟叶代谢组影响的研究尚未见报道。为此，采集了八大香型风格区典型烟叶产区的烟叶样品，结合气象数据，对烟叶中的质体色素、生物碱、有机酸、游离氨基酸、萜类化合物和甾醇类化合物进行了靶向分析，同时分别使用基于LC-MS和GC-MS的烟叶非靶向检测方法对烟草代谢组进行了测定［12］，分析了八大香型风格区中鲜烟叶代谢物与不同气象因子的相关性，旨在了解烟草各类代谢物（脂类化合物、含氮化合物、糖类化合物、有机酸类化合物、核酸类化合物和甾醇类化合物）的生态成因。

1 材料与方法

1.1 实验材料

根据八大香型风格区划选择典型产区，于2013年至2015 年间进行样品采集（表1 和表2）。样品为成熟期第10叶位鲜烟叶，相邻的3株烟叶合并为1个样品，每个地点每个品种设6个生物学重复。样品采集后立即液氮冷冻，之后在-70 ℃条件下进行运输和储藏。

表1 2013、2014年度新鲜烟叶样品来源Tab.1 Sources of fresh tobacco leaf samples in 2013 and 2014

表2 2015年度新鲜烟叶样品来源Tab.2 Sources of fresh tobacco leaf samples in 2015

1.2 代谢组学检测方法

于鲜烟叶样品获取当年采集代谢组学数据，采集方法参照文献［12］。

1.3 数据分析

通过搜索数据库（自建数据库、METLIN、NIST等）、标准品比对等定性方法，共鉴定出500余种烟草代谢产物，经过数据的标准化（非靶向方法采用内标校正）和归一化（UV、Par、Z-score 等）处理后，使用Simca 13.0 软件进行主成分（PCA）分析和正交偏最小二乘（OPLS）判别分析，获取不同香型风格区之间的差异代谢物；计算Pearson 相关系数，考察香型风格区生态特征与该区特征代谢产物形成的关系；使用MetaboAnalyst 3.0进行代谢途径富集分析。

1.4 香型风格相关代谢物的筛选

按照香型风格区对烤前鲜烟叶样品进行分组，采用正交偏最小二乘回归（OPLS），根据所获得的代谢组数据进行判别分析（OPLS-DA），成功建立了基于OPLS的判别分析模型（该模型的可靠性判别指标R2和Q2均大于0.8）。基于OPLS-DA模型对分组的贡献大小（VIP 值）对代谢物进行排序。一般认为VIP值大于1的代谢物为不同组间的差异代谢物，对分组的贡献较大。经分析，共获得116种与香型风格区划相关的代谢物，这些代谢物分别属于脂类物质（52 种）、生物碱（4 种）、多酚（3 种）、有机酸（15 种）、氨基酸（9 种）、甾醇（2 种）、糖类物质（9 种）和其他（22种，包括核酸和维生素等）。

1.5 生态及气象数据的采集

查阅当年气象局官方网站获取的气象数据，以大田生育期日均温度（T）、移栽伸根期温度（T1）、旺长期温度（T2）、成熟前期温度（T3）、成熟中后期温度（T4）、成熟后期温度（T5）、平均昼夜温差（T-delta）、生育期平均日照时数（S）、移栽伸根期日照时数（S1）、旺长期日照时数（S2）、成熟前期日照时数（S3）、成熟中后期日照时数（S4）、成熟后期日照时数（S5）、总日照时数/移栽后至采收的生长周期（S-percent）、生育期平均降雨量（R）、移栽伸根期降

雨量（R1）、旺长期降雨量（R2）、成熟前期降雨量（R3）、成熟中后期降雨量（R4）、成熟后期降雨量（R5）等气象数据和与香型风格相关的116种代谢物进行Pearson相关分析。

1.6 不同香型风格烟叶代谢特征形成的生态成因分析

对各生长期的温度、日照时数、降雨量等与香型风格相关的116 种代谢物进行Pearson 相关分析，判断八大香型风格区的鲜烟叶代谢特征形成的生态成因。

2 结果与讨论

2.1 不同香型风格烟叶代谢特征的生态成因分析

香型风格相关的116 种代谢物与各香型风格区生态条件的相关性如图1～图5所示，整体来看，代谢物积累与温度、日照时数、降雨量等存在显著的相关关系，温度和日照时数对代谢物积累的影响多为正相关，而降雨量的影响则相反，多为负相关。

2.2 温度、日照时数、降雨量对脂类积累的影响

由图1和图2可见，降雨量不利于脂类物质的积累，大部分脂类代谢物与降雨量负相关，尤其是大田后期的降雨量（成熟中后期R4、成熟后期R5）不利于脂类物质的积累，且相对于温度和日照时数，降雨量对磷脂酰胆碱（PC）、磷脂酰乙醇胺（PE）、甘油三酯（TG）的影响更弱，其相关性较小；温度尤其是大田生长中后期（旺长期T2 至成熟中后期T4）的温度与甾醇脂、鞘糖脂以及大部分的双半乳糖甘油二酯（DGDG）、半乳糖基甘油二酯（MGDG）、PC 和PE 的含量正相关，即这一阶段温度高则有利于这些脂类物质的积累；而TG的积累则正好相反，大部分TG的积累都与这一生长阶段的温度负相关，平均昼夜温差对脂类物质积累的影响较小。日照时数对脂类物质积累的影响与温度类似，不同的是生长后期日照时数（S5）仍对脂类物质积累有较大的影响，S5 与鲜烟叶中脂类代谢物的相关性较高。Li等［9］基于河南、贵州和云南3个产地成熟期鲜烟叶脂质组的研究表明，脂类代谢物的积累受气候因素的影响较大，尤其以旺长期和成熟期温度的影响最大，其次为成熟期日照时数和降雨量，该结论与本文中的研究结果一致。

图1 温度、日照时数、降雨量等与DGDG等脂类物质的相关分析图Fig.1 Correlations between temperature，sunshine hours，precipitation and different lipids such as DGDGs

图2 温度、日照时数、降雨量等与PC、PE等脂类物质的相关分析图Fig.2 Correlations between temperature，sunshine hours，precipitation and different lipids such as PC and PE

2.3 温度、日照时数、降雨量对氨基酸、多胺、生物碱等含氮化合物的影响

由图3 可见，温度、日照时数等对谷氨酸（Glutamic acid）、天（门）冬氨酸（Aspartic acid）、5-羟脯氨酸（5-oxoproline）、苯丙氨酸（Phenylalanine）、磷酸乙醇胺（Ethanolamine phosphate）表现出较强的负相关，与其他含氮化合物则具有较弱的正相关；上述5种化合物与大田生长前期温度（T1、T2、T3）和日照时数（S1、S2、S3）的相关性较高，这一时期温度较高或日照时数较长，不利于这些化合物的积累；降雨量在成熟后期（R5）对含氮化合物积累的影响较大，这一时期降雨量较多有利于上述5种化合物的积累，但不利于亚精胺（Spermidine）的积累。上述结果与Zhao等［10-11］对谷氨酸、天冬氨酸、5-羟脯氨酸的研究结果一致，与苯丙氨酸的研究结果则相反，这可能是由分析样本的年度差异或苯丙氨酸对气候响应较为复杂等因素造成的。

图3 温度、日照时数、降雨量等与含氮化合物的相关分析图Fig.3 Correlations between temperature，sunshine hours，precipitation and nitrogenous compounds

2.4 温度、日照时数、降雨量对糖、有机酸等代谢物的影响

如图4 所示，除赤藓糖醇（Erythritol）、阿糖醇（Arabitol）、木糖醇（Xylitol）、熊果苷（Arbutin）和葡萄糖酸（Gluconic acid）外，其余代谢物与大田生长中前期（移栽伸根期至成熟前期）的温度和日照时数负相关，而与这一时期的降雨量正相关。其中，赤藓糖醇和阿糖醇与整个生育期的温度和日照时数呈弱的正相关关系，与降雨量弱负相关，这与Zhao 等［10］的研究结果相似。移栽伸根期的降雨量、日照时数、温度等对图4所示代谢物积累的影响最大，其次是旺长期，而成熟前期的温度、日照时数和降雨量影响则较小。成熟后期的温度（T5）与大部分代谢物积累呈明显的正相关关系，而这一时期的日照时数对代谢物积累的影响较小，降雨量对部分代谢物，如半乳糖醇（Galacitinol）、甘油磷酸盐（Glycerol 1-phosphate）和异柠檬酸（Isocitric acid）积累的影响较大，具有明显的正相关性（相关系数大于0.84）。有机酸受光温水调控较有规律，除葡萄糖酸（Gluconic acid）外，有机酸受大田生长中前期（移栽伸根期至成熟前期）温度和日照时数的负调控，受大田生长后期温度（T4 和T5）尤其是成熟后期温度（T5）的正调控，降雨量在整个生育期都表现出对有机酸积累的正调控模式，两者正相关，这与Zhao等［10］的研究结果一致。

图4 温度、日照时数、降雨量等与糖、有机酸等的相关分析图Fig.4 Correlations between temperature，sunshine hours，precipitation and sugars，organic acids，etc.

2.5 温度、日照时数、降雨量对核酸、甾醇等代谢物积累的影响

如图5 所示，大田生长中后期（成熟中后期、成熟后期）尤其是成熟后期的降雨量（R5）对代谢物的影响较大，其他时期的降雨量对核酸、甾醇等代谢物的影响较小，其相关系数较小，相关性较弱；日照时数尤其是大田生长中前期的日照时数（S1、S2、S3）与代谢物积累的相关度较高，且多为负相关，仅有核糖酸-γ-内酯（Ribonic acid-gamma-lactone 2）、植物鞘氨醇（Phytosphingosine）、2,3-辛二酮（2，3-Octanedione）与日照时数正相关（相关系数＞0.6）；温度对代谢物积累的影响呈现两段化，即生长中前期（T1、T2、T3）与成熟后期（T5）对代谢物积累的影响正好相反。除上述3 种代谢物外，有6 种代谢物与大田生长中前期的温度（T1、T2、T3）具有较强的负相关关系。Zhao 等［10］的研究中中分析过核糖酸-γ-内酯与光、温、水的相关性，其结果与本研究中的结果一致，即与温度、日照时数正相关，与降雨量负相关。

3 结论

每个风格区划鲜烟叶的特征代谢物均与生态条件有一定的相关性，温度、日照时数、降雨量等生态特征参数的变化可以解释大部分特征代谢产物积累量的高低，表明鲜烟叶的代谢特征与环境生态条件紧密相关。其中与代谢物含量有较高相关性的气候因子为大田中后期温度和大田中后期日照时数。除此之外，降雨不利于脂类物质的积累，大田生产中后期温度较高则有利于一些脂类物质的积累。大田生长前期温度较高或日照较长不利于多数含氮化合物的积累，而成熟后期的降雨则有利于多数含氮化合物的积累，但不利于亚腈胺（Spermidine）的积累。除葡萄糖酸（Gluconic acid）外，有机酸受大田生长中前期温度和光照的负调控，受大田生长后期温度尤其是成熟后期温度的正调控，降雨量在整个生育期都表现出对有机酸积累的正调控模式。大田生长中后期尤其是成熟后期的降雨量对核酸甾醇等代谢物的影响较大，其他时期的降雨量则影响较小，而大田生长中前期的日照时数与核酸甾醇的积累多为负相关。