常见酸奶酸菜中乳酸菌的筛选及乳酸菌素的特性研究

鲁志彬，柴新义，李强，周玲玲，胡兴翠

乳酸菌是一类革兰氏阳性球菌或杆菌、无芽孢、无运动性、接触酶阴性，能够发酵一些碳水化合物产生乳酸的细菌的总称[1]。乳酸菌的功能特性是近百年来相关科学工作者们一直比较偏爱的研究热点，也是目前人类利用较为全面的微生物，乳酸菌中的一些益生菌已被广泛应用到酸奶酸菜等发酵食品的制作和微生态制剂的生产中。

乳酸菌素是某些乳酸菌在代谢过程中通过核糖体合成机制产生的分泌到环境中的一类具有生物活性的蛋白质、多肽或前体多肽，它对其他相近种类的细菌具有抑制作用，但是其抑菌范围又不仅仅局限于有亲缘关系的种，且产生菌对其分泌的乳酸菌素有自身免疫性[2]。

近几年来，许多国家出现过超级细菌感染的病例，这是由于抗生素的滥用导致细菌耐药性的加剧而产生的，而且抗生素的长期应用会引起肠道菌群的紊乱、抗生素伴联腹泻等，这已成为一个严重的公共健康问题，所以人们开始试图研究其他副作用较弱的抗菌剂，乳酸菌素作为一种天然抗菌肽，安全无毒，在为肠道内可被降解，不会引起细菌的抗药性，并且可以选择性的杀死肠道内有害微生物，不破坏肠道菌群的平衡，抑菌实验表明，乳酸菌素对一些致病的革兰氏阳性菌和阴性菌均有不同程度的抑制作用，因此，它可以用于治疗肠内消化不良、腹胀、腹泻、肠炎等疾病[1]。在幼儿时期，很多的孩子容易出现消化不良和腹胀的肠道问题，而小孩也不喜欢吃药，同时使用别的抗生素对幼儿的身体也会造成伤害，这时如果可以让小孩食用含有乳酸菌的酸奶等食品或许可以起到一举两得的效果；在老年时期，老年人的肠道内有益菌群数量下降的很厉害，这时乳酸菌类的药品或食品则能起到调节肠道微生物生态平衡防止大肠内蓄积有害物质，可以延缓机体的衰老，促进胃肠蠕动与胃液分泌的作用。

乳酸菌素也可广泛应用到乳制品、罐头食品、肉制品、啤酒饮料等食品工业中，例如在干酪加工过程中，尽管经过高温灭菌，但仍会有耐热性的革兰氏阳性菌孢子（肉毒素梭菌和厌氧梭菌芽孢等）存在，而加入nisin乳酸菌素可有效阻止这些孢子的萌发和毒素形成，印度的牛奶生产中使用了nisin让仅能存放3～7天的消毒牛奶延长保存至60余天；利用乳酸菌素不抑制酵母菌生长这一特性，可将它应用于啤酒饮料等的生产酿造中防止其他腐败菌的污染[3]。总之，使用乳酸菌素这类生物添加剂不仅可以较大地延长贮存期还可以保证食品的安全性、良好的风味和质地。

以益生乳酸菌为基础，衍生出的众多系列产品以其原生态、绿色、安全、无毒副作用的特点完全符合现代社会消费者对天然、绿色有机食品的追求。本实验为进一步的实际应用提供一些基础理论依据。

1 实验材料与方法

1.1 实验材料

名称 时间 地点市售蒙牛酸奶 2014.5.1 滁州学院后门华联超市皖东农村地区常见的传统自制酸菜2014.4.6 滁州市全椒县农村居民家中

大肠杆菌、金黄葡萄球菌、枯草芽孢杆菌（均为滁州学院微生物实验室保存的菌种）

1.2 主要培养基[4,5]

MRS固体培养基：蛋白胨 10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，葡萄糖20g，吐温80 1ml，K2HPO4 g，醋酸钠5g，柠檬酸二铵2g，MgSO4.7H2O 0.58g，MnSO4.4H2O 0.25g，琼脂20g，超纯水1000ml，pH调至6.0。

MRS液体培养基：蛋白胨 10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，葡萄糖20g，吐温80 1ml，K2HPO4 g，醋酸钠5g，柠檬酸二铵2g，MgSO4.7H2O 0.58g，MnSO4.4H2O 0.25g，超纯水 1000ml，pH 调至 6.0。

分离培养基：蛋白胨 10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，葡萄糖20g，吐温80 1ml，K2HPO4 g，醋酸钠 5g，柠檬酸二铵 2g，MgSO4.7H2O 0.58g，MnSO4.4H2O 0.25g，CaCO3粉末（加入2%）琼脂10g，超纯水1000ml。

营养琼脂培养基：牛肉膏 3g，蛋白胨 10g，NaCl 5g，琼脂20g，超纯水1000ml，pH7.2。

肉汤培养基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，超纯水1000ml，pH7.2。

PY基础培养基：蛋白胨5g，胰蛋白胨5g，酵母粉10g，盐溶液40ml，超纯水1000ml。

葡萄糖产气培养基：在 PY基础培养基（1000ml）中加入30g葡萄糖和0.5ml的吐温80，再添加6g琼脂做成软琼脂柱，分装于试管中，高度为4～5cm，然后将乳酸菌悬液0.1ml加入融化的软琼脂柱内（温度约为 47℃～48℃，试管不烫手即可）。混匀后在上面加盖一层约7 mm的2%琼脂，置于适温培养。观察是否有气泡出现将2%的琼脂层向上顶起。

1.3 主要实验仪器与设备

仪器名称 仪器型号 生产厂家生化培养箱立式压力蒸汽灭菌器生物显微镜电子分析天平雷磁p H计台式电动离心机洁净工作台游标卡尺实验室超纯水机海尔家用电冰箱数显恒温水浴锅M H P-1 6 0 S Y M S K 2 0 0 F A 2 0 0 4 A P H S-3 E 8 0-2 S h r-C J-2 F D 0～1 5 0 m m M a s t e r-R U V F B C D-2 1 6 Z D J H H-6可见分光光度计电热恒温鼓风干燥箱微量移液器7 2 3 C D H G-9 2 0 3 A 1 0 0 0 μ L, 0 0 μ L上海三发科学仪器有限公司上海三申医疗器械有限公司麦克奥迪实业集团有限公司上海精天电子仪器有限公司上海精密科学仪器有限公司金坛市杰瑞尔电器有限公司上海博讯实业有限公司上海申韩量具有限公司上海和泰仪器有限公司青岛海尔股份有限公司江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司上海欣茂仪器有限公司上海三发科学仪器有限公司T h e r m o公司

1.4 实验步骤与方法

1.4.1 乳酸菌的分离

在超净台中完成以下的操作，将冷却至50℃左右的20ml MRS固体培养基倒入培养皿，待培养基完全凝固后再将加有2%CaCO3的半固体MRS培养基10ml平铺至上面；取待筛选的乳酸菌材料1ml加入到装有9ml无菌水的试管中，连续10倍梯度稀释，然后用移液器吸取5组适当浓度梯度的菌液200μL，分别涂布于上述双层平板上，放置到生化恒温培养箱中37℃培养48～72h[1]。将具有明显溶钙圈、革兰氏染色阳性、接触酶反应阴性的乳白色或白黄色且表面圆滑的菌落初步确定为乳酸菌[6]。

1.4.2 乳酸菌的纯化

将革兰氏染色阳性，接触酶阴性的菌落进行纯化分离出单个的菌体。在超净台中，用无菌接种环挑取少许乳酸菌菌落在MRS固体培养基平板上反复划线分离，直至革兰氏染色在显微镜下观察菌株颜色、大小、形态一致[6]。将单个菌株形成的菌落在平板上划线培养使其扩大保存备用。

乳酸菌菌株的初步鉴定：根据乳酸菌在MRS固体平板上生长的菌落形态特征和革兰氏染色显微镜下观察乳酸菌菌体的形态特征来做出初步的判断。

1.4.3 乳酸菌菌悬液的制备

用移液管吸取25ml MRS液体培养基装至带塞的试管中，用无菌接种环从上述已纯化的乳酸菌平板上挑取 1～2环乳酸菌落接种到装有 25ml液体培养基的试管中，置上橡胶塞放入生化恒温培养箱中37℃培养18h左右，至看见培养基明显变浑浊即可。

1.4.4 甘油法和斜面法保藏菌种[7]

甘油长期保藏：此方法是将菌种长期保存待以后实验室中使用，首先制备好无菌甘油(60%浓度)，用移液器吸取 0.5ml上述乳酸菌悬液置入2mlEp管中，再加入0.5ml的无菌甘油于培养液面上，振荡混匀，最后将Ep管作好标记置于-20℃低温冰柜中保藏。

斜面低温保存：此方法一般只适于短期（1～3个月）保藏使用；制作好试管斜面，在超净台中，用无菌环蘸取上述乳酸菌悬液（注意不要滴撒）在斜面上从底往口划出，将试管口在酒精灯上灼烧一下，塞上试管塞并贴好标签，放在37℃培养箱中24h培养，每个菌种平行做5个保藏。放置于 4℃冰箱中保藏，如温度太低，斜面培养基会因结冰脱水而致菌种死亡。

1.4.5 乳酸菌生长曲线的测定

生长曲线的测定可利用比浊法来测定，即吸光值来绘制出培养时间与生长量的关系,从筛选出来的乳酸菌中选取4株来进行测定。将各组试管中分别装入25ml的MRS液体培养基，然后用移液器按1%的量接入乳酸菌种液，将接入菌种液的培养基放入生化恒温培养箱中37℃培养，然后每隔2h取出相应的试管，以未接入任何菌种的培养基作为空白对照，用 723分光光度计测出OD600nm值，取平均值，并记录[8,9]。

1.4.6 乳酸菌生长过程中pH的变化

以乳酸菌培养时间为横坐标，pH为纵坐标绘制出乳酸菌在生长过程中 pH值的变化情况。向各组试管中分别加入 25ml的液体培养基，12个为一组，做三组平行，按1%的量接入乳酸菌种液，置上塞子放入生化恒温培养箱中培养，每隔2小时取出相应的试管（连续测24h）[10]。pH计测出其pH值大小，取平均值，并记录分析。

1.4.7 不同pH下乳酸菌的生长情况

以pH为横坐标，OD600nm值为纵坐标绘制出乳酸菌的耐酸性情况。用HCl溶液和NaOH溶液分别调节液体培养基pH值为1.5、2.5、3.5、4.5、5.5、6.5、7.5、8.5、9.5，然后加入25ml至相应的试管中，按1%的量接入菌种液，置于生化恒温培养箱中培养20h后，测出其分光光度值，并绘制出曲线图。

1.4.8 不同NaCl浓度下乳酸菌的生长情况

在液体培养基中分别加入0%、1.5%、2.5%、3.5%、4.5%、5.5%、6.5%、7.5%、8.5%、9.5%的量的NaCl,取相应的培养基25ml至试管中并标记，然后按1%的量接入SC-3和SC-5菌种液，置于生化恒温培养箱中20h后取出，测定其吸光值，取平均值，并绘制出曲线图[10]。

1.4.9 乳酸菌耐亚硝酸盐实验

NaNO2作为食品添加剂被广泛地应用在发酵肉制品、酸菜等的制作中，同时，酸菜泡菜等的制作过程中自身也会产生亚硝酸盐，国家对于NaNO2的添加量有严格的限定，所以一些酸菜发酵中的乳酸菌种对亚硝酸盐得有一定的耐受性[10]。在培养基中分别加入0.01%、0.015%、0.02%质量分数的NaNO2观察亚硝酸盐对所筛选的乳酸菌种的生长影响情况。

2 产广谱抑菌活性乳酸菌细菌素的研究

采用牛津杯琼脂扩散法[11]：将加热融化的水琼脂（2%）10ml倒入无菌培养皿中，完全凝固后，取3个已灭菌的牛津杯均匀地放置在平板上。吸取适宜浓度的指示菌菌悬液 200μL加入半固体营养琼脂培养基中混匀后迅速倒入上述平板上，待凝固后取出牛津杯，然后吸取200μL的乳酸菌悬液注入牛津杯形成的圆孔内置于 4℃冰箱中扩散1h，然后放于37℃生化恒温培养箱中培养20h后，用游标卡尺测量抑菌圈的直径（mm）。

首先对所筛选出的多株乳酸菌进行抑菌能力的初步检测，然后选取其中具有较强抑菌活性的3株进行进一步的研究具有较强抑菌活性的菌株的进一步实验

2.1 有机酸的影响排除试验[12]

用1mol/L的HCl和1mol/LNaOH调节乳酸菌的发酵上清液pH至4.5，并将相应pH值的MRS液体培养基作为对照，然后进行抑菌试验。

2.2 过氧化氢的影响排除试验[12]

将具有较强抑菌效果的乳酸菌发酵上清液，置于80℃水浴10min，然后进行抑菌试验。

2.3 酶敏感性试验[12]

在进行酸排除、过氧化氢干扰排除后的菌株发酵上清液进行蛋白酶的敏感性试验，将乳酸菌的发酵上清液适量分装到不同的试管中并将pH值分别调到胰蛋白酶和胃蛋白酶的最适pH值6.0和2.0，按终浓度为1mg/ml加入两种蛋白酶，37℃水浴2h，再将pH值调到4.5后进行抑菌试验。

3 结果与分析

乳酸菌的糖发酵试验[5]。

根据乳酸菌的显微镜下细胞形态以及生理生化试验和糖发酵试验可以判断出 YL-2和 SC-4属于乳杆菌属，YL-79是链球菌属，SC-1和SC-5属于片球菌属，SC-3是明串珠菌属。

3.1 生长曲线实验结果

从图1中可以看出YL-2和YL-79 2株乳酸菌的生长速度相似，在培养4h左后后进入对数生长期，生长较快，14～16h后进入稳定期，而SC-3和SC-5乳酸菌生长速度相对较慢，特别是SC-5菌株在培养 10h左右后才进入快速生长期，在22～24h后进入生长稳定期。

图1 SC-5菌株在显微镜下的形态（16×100）

表1 筛选出的乳酸菌菌落形态和菌体细胞特征

3.2 生长过程中pH变化结果

从图2中可以看出各株乳酸菌在4～6h后pH值下降明显，YL-2和YL-79菌株变化趋势相似，最终pH值都稳定至4.0左右，SC-3和SC-5菌株的pH值下降相对较弱，其中SC-3 pH值最终稳定在4.5左右，SC-5 pH值最终稳定在5.0左右。几株乳酸菌在培养24h后pH值均下降至5.0以下，可满足于众多发酵制品的要求。

图2 SC-3菌株在显微镜下的形态（16×100）

3.3 不同pH生长实验结果

从图 3中可以看出各株乳酸菌在 pH5.5～6.5之间均可以生长良好，除了 SC-5菌株可以在pH4.5左右生长相对较好，其它3株在pH4.5附近都生长较弱，在pH9.5附近各菌株基本上不生长或生长较弱。可以观察出，乳酸菌的生长环境偏向于酸性环境，同时在其生长过程中由于产生酸性物质，使得乳酸菌的最终发酵环境也会被酸性化，这对于抑制其它的杂菌生长和防止腐败产生具有重要作用，在食品工业生产中意义重大。

图3 YL-79菌株在显微镜下的形态（16×100）

3.4 不同NaCl浓度下生长结果

在图4可以看出，从传统自制酸菜中筛选出来的2株乳酸菌生长较适的NaCl浓度为0～3.5%，当盐浓度较高时生长较差，在盐浓度为6.5%时乳酸菌仍可生长，但生长情况较差，在NaCl浓度达到8.5～9.5%时，乳酸菌生长极为缓慢，甚至难以生长，所以在一些酸菜、香肠等腌制品的制作过程中食盐的添加量需要谨慎把握，不可放入过多，否则可能会导致发酵的失败。

图4 YL-2菌株在显微镜下的形态（16×100）

3.5 不同NaNO2添加量下的生长结果

从图5中可以清楚地看到培养基中亚硝酸盐的加入对乳酸菌的生长产生了明显的影响，当NaNO2添加量为0.01%时，SC-3菌株的菌体密度下降了 11.5%，SC-5菌株的菌体密度下降了13.5%，当 NaNO2的添加量加到 0.02%时，SC-3和SC-5的菌体密度分别下降了33%和31.3%，虽然亚硝酸盐的添加让乳酸菌的生长受到影响，但是并没有完全抑制乳酸菌的生长，由此可见，此 2株乳酸菌是可以耐受亚硝酸盐的，对于酸菜发酵过程中产生的以及额外添加的亚硝酸盐具有一定的耐受性，可以作为发酵制作过程中的发酵菌种。

图5 乳酸菌的生长曲张

3.6 乳酸菌素的抑菌活性结果与分析

从表3中的数据可以看出，上清液在排除相关因素干扰后，抑菌圈的变化并不明显，而经过胰蛋白酶和胃蛋白酶 37℃处理 2h后，抑菌圈显著减小，基本上看不到抑菌效果。由此表明乳酸菌在代谢过程中产生了某些多肽类抑菌物质即乳酸菌素，很多细菌素的抗菌范围通常较窄，但是根据图6可以看出，在本实验中，所筛选出的乳酸菌产生的乳酸菌素既可以抑制 G+菌也可以抑制G-菌，具有较为广谱的抑菌作用。

表2 乳酸菌的生理生化实验结果

表3 乳酸菌素的抑菌活性

图6 乳酸菌的pH值的变化

图7 不同pH值下乳酸菌的生长

图8 不同浓度NaCl中乳酸菌的生长

图9 不同浓度的亚硝酸盐对乳酸菌的生长影响

图10 蛋白酶处理后的抑菌结果

图11 乳酸菌发酵上清液原液的抑菌效果

图12 3菌株原始发酵上清液的抑菌圈大小不一

4 讨论

本次实验中筛选出多株乳酸菌，包括乳杆菌属、片球菌属、链球菌属、明串珠菌属等，根据相应的生理生化鉴定判断出从酸奶中筛选出来的有保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌，从滁州农村地区传统发酵的酸菜中筛选出的有弯曲乳杆菌、片球菌属、明串球菌属等。根据品尝，发现农村居民家中自制的传统酸菜具有独特的风味，味道可口，所以根据实验基础，设想如果能把农村自制的传统酸菜中常见的发酵乳酸菌种一些在食品工业中已被广泛利用的有益乳酸菌（保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌等）混合发酵制作酸菜、泡菜等食品，一定会生产出风味独特、质地良好且更具皖东地区地方特色的乳酸菌发酵食品的。

乳酸菌是人类和动物肠道中正常菌群中的优势菌，具有许多对人类和动物健康有益的生理功效，大多数乳酸菌是公认为安全的微生物，人们也一直致力于对其的研究。在日常生产生活中也被广泛地应用于诸多的发酵食品中，例如发酵罐头制品、肉制品、酸奶发酵等，为这些食品提供了独特的良好风味，让人们颇为喜爱，同时乳酸菌不仅为食品提供了良好风味，它在其中为食品的防腐保鲜也具有重要作用，在现代社会中，经济的迅猛发展和人民生活水平的显著提高，人们对绿色健康的重视程度也日益增强，而乳酸菌素作为一种无毒的、在肠道中可被降解的绿色天然防腐剂，正迎合了人们的需要，相信在将来随着生物技术的不断提高，结合基因工程的手段选育出高产乳酸菌素的菌株，以及对乳酸菌素机理的研究深入，此类产品必将会得到更加广泛的应用。

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