辽宁产山里红中总黄酮的含量测定

刘倩，吴雪，祁磊，何俊儒，刘彬，黄占波

(辽宁科技学院 生物医药与化学工程学院，辽宁 本溪 117000)

辽宁产山里红中总黄酮的含量测定

刘倩，吴雪，祁磊，何俊儒，刘彬，黄占波

(辽宁科技学院 生物医药与化学工程学院，辽宁 本溪 117000)

〔目的〕测定辽宁产山里红中总黄酮的含量。〔方法〕采用分光光度法，以芦丁为对照品，应用亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠进行显色反应，在510nm波长处测定鲜品山里红中总黄酮的含量。〔结果〕不同产地山里红新鲜果实样品中总黄酮含量为0.40% ～ 1.81%，含水量为72% ～ 76%。〔结论〕该研究可用于山里红的质量控制，为山里红资源的综合应用提供参考。

山里红；总黄酮；可见分光光度法；含量测定

山里红Crataegus pinnatifida Bge. Var. major N.E.Br.为蔷薇科山楂属果树的果实，又称北山楂，是中国药典收载的山楂药材两个来源品种之一〔1〕，被称为仙果，在我国北方广泛栽培，是天然的绿色、有机食品，是重要的药食同源植物。整个辽宁地区分布有大量的野生和栽培的山里红植物资源，被誉为东北野果中的珍品，其特点是个头小，果肉薄，发红发软，表面鲜红色至紫红色，有光泽，口味甜酸略带苦，口感优于山楂，野生居多〔2〕。山里红含有多种生物活性物质，其中，黄酮类化合物是其发挥有效作用的主要活性成分，含量较高，具有抗氧化、预防心脑血管疾病、降脂、消炎、防衰老、抗癌等生物活性〔3〕，有较高的药用和保健价值。辽宁地区山楂种植面积和野生山里红的产量比较大，除了具有食用价值外，可以广泛用于医药和保健领域。为了明确辽宁地区山里红中黄酮类化合物含量及其品质、更好地综合利用山里红植物资源，逐渐拓宽其深加工途径，本试验以辽宁地区山里红为研究对象，采用可见分光光度法，对不同来源山里红中总黄酮的含量进行了测定，旨在为深入开发山里红产品提供基础研究数据和技术支持。

1 仪器与材料

1.1 仪器

T6新世纪紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限公司)；KQ-300VBD型三频数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；CPA225D微量电子天平(赛多利斯科学仪器(北京)有限公司)；RE52-99型旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)；SHZ-CB型循环水式多用真空泵(巩义市予华仪器有限责任公司)。

1.2 材料

芦丁对照品(批号：16091901)购自天津月牙湖科技有限公司；乙醇、氢氧化钠、亚硝酸钠、硝酸铝均为国产分析纯，购于国药集团化学试剂公司；实验用水为蒸馏水。

山里红样品均于2016年10～11月果实成熟期采集自辽宁东部地区，4℃冷藏，实验前去核，果肉捣碎备用。

2 方法与结果

2.1 供试品溶液的制备

取新鲜山里红，去核，果肉打碎，称取2.0g，置于100mL锥形瓶中，加60%乙醇40mL，300W超声提取2次，每次30min，过滤，合并滤液，减压浓缩，以60%乙醇溶解并定容至25mL，作为供试品溶液。

2.2 对照品溶液的制备

精密称取芦丁对照品5mg，用60%乙醇溶解并定容至50mL，制得浓度为0.1mg/mL的对照品溶液。

2.3 标准曲线的绘制

精密吸取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL芦丁对照品溶液，分别置于10mL容量瓶中，加60%乙醇至5ml，各加5%亚硝酸钠溶液0.3mL，摇匀，放置6min后再各加10%硝酸铝溶液0.3mL，摇匀，放置6min后再加4%氢氧化钠溶液4.0mL，最后加60%乙醇至刻度，摇匀，放置15min；以蒸馏水做空白，在510nm波长处测定吸光度值〔4〕。以对照品溶液浓度(mg/mL)与吸光度(A)进行线性回归，得回归方程A=12.29C+0.001，R2=0.9993，结果表明芦丁在0.01～0.05mg/mL浓度范围内线性关系良好。

2.4 方法学考察

（14）这兴旺的景色使人联想到，喀麦隆政府在强调以农业为基础，执行“绿色革命”政策中取得的可喜成就。（1978·《人民日报》）

1)精密度试验

精密吸取同一对照品溶液，按2.3项下方法显色后重复测定6次，计算RSD值，考察其精密度。结果显示，相对标准偏差RSD为1.01%，表明仪器精密度良好。

2)稳定性试验

取同一供试品溶液，按2.3项下方法显色后，分别在5、10、15、30、60、90min测定吸光度，计算相对标准偏差。结果显示吸光度随时间呈逐渐减弱趋势，在30min内样品溶液吸光度降低不显著，相对标准偏差RSD值为1.57%，到60min时样品吸光度值的RSD为3.1%，并且随着时间延长持续降低。结果表明，供试品溶液充分显色后在30min内较为稳定，因此要在反应结束后30min内完成测定，以免结果不准确。

3)重复性试验

取同一份样品，按2.1项下方法制备6份供试品溶液，按2.3项下方法显色后测定吸光度。计算相对标准偏差RSD为2.5%，结果表明方法重复性良好。

4)加样回收率试验

精密称取9份已知总黄酮含量的山里红样品，按2.1项下方法制备供试品溶液，分别按高、中、低的比例加入一定量的芦丁对照品，按2.3项下方法显色后测定吸光度，计算回收率。结果平均加样回收率为102.6%，RSD为2.18%，表明方法的准确率较高，适用于山里红总黄酮含量的测定。

2.5 总黄酮的含量测定

精密吸取供试品溶液1.0mL，按2.2项下方法显色后测定吸光度，按下式计算不同来源山里红样品中总黄酮的含量，结果见表1。

山里红总黄酮含量(%)=C×V×D× 10-3/W*100%

式中：C为供试品溶液中总黄酮的浓度(mg/mL)；V为供试品溶液的体积(mL)；D为供试品溶液的稀释倍数；W为样品的取样量(g)。

表1 山里红鲜品中总黄酮的含量(%)

由表1可知，采集的不同产地山里红鲜品中总黄酮含量约为0.40% ～ 1.81%，平均含量为0.83%。总黄酮含量最高的是采集自本溪石桥子镇的样品，达到1.81%，该样品果实直径较大、果皮颜色深红、果肉较厚、颜色鲜黄；总黄酮含量最低的是本溪小市镇荒山的样品，仅为0.40%，该样品果实直径小、果肉很薄。不同来源山里红中总黄酮含量存在较大差异，可能是与山里红的品种和生长环境有关，山里红分为栽培类型和非栽培类型，没有经过栽培的野生山里红总黄酮含量相对较低，经过栽培之后任其自然生长的山里红总黄酮含量相对较高；同时，生长在土质肥沃环境的山里红其果肉较厚、颜色较深，总黄酮含量相对较高；反之，总黄酮含量相对较低。

另外，本实验采用中国药典中的烘箱法测定新鲜山里红中的水分，不同来源山里红的含水量在72～76%范围内。

3 讨论

本研究首先通过预实验考察了山里红总黄酮供试品溶液的制备工艺，采用单因素实验考察了提取方法以及提取溶剂、溶剂用量、提取时间等影响测定结果的因素，最终确定采用超声提取法，用60%乙醇为提取溶剂提取30min，此条件下测得的总黄酮含量较高。

采用分光光度法测定山里红总黄酮的实验中发现，显色反应完成后，供试品溶液的吸光度值会随显色时间的变化而呈逐渐降低趋势，15min内变化不显著，吸光度值较为稳定，30min后供试品溶液的吸光度值下降明显，因此应严格控制实验条件，尽量在显色反应完成后15min内测定供试品溶液的吸光度值，以免影响测定结果的准确性。

〔1〕 国家药典委员会.中华人民共和国药典一部〔S〕.北京：中国医药科技出版社，2010：29.

〔2〕 刘波.野生山里红与山楂复合果酒的优化工艺〔J〕.食品研究与开发，2015，36(8)：61-64.

〔3〕 沈燕琳，董文轩，李鲜，等.山楂酚类物质及其生物活性研究进展〔J〕.园艺学报，2013，40(9)：1691-1700.

〔4〕 黄优生，谢明勇，张中伟，等.山楂总黄酮的测定〔J〕.南昌大学学报(理科版)，2006,30(5)：473-477.

Determining the Total Content of Ketone in Crataegus pinnatifida at Liaoning Provincial

LIU Qian; WU Xue; QI Lei; HE Jun-ru; LIU Bin; HUANG Zhan-bo

(SchoolofBiomedicineandChemicalEngineering,LiaoningInstituteofScienceandTechnology,Benxi,Liaoning, 117004,China)

[Purpose]: To determine the total content of ketone in crataegus pinnatifida;[Method]: To use the spectrophotometry, take rutin as the contrast material,and use sodium nitrite-aluminium nitrate-sodium hydroxide to make developing reaction, and to determine the total content of ketone at wave length 510 mm; [Result〗; Total content of ketone in various sample of new crataegus pinnatilida is within 0.40%～1.81%, water content is within 72%～76%; [Conclusion]:The results can be used to control the quality of crataegus pinnatifida, and provide reference for comprehensive utilization of crataegus pinnatifida.

Crataegus pinnatifida；Total ketone；Visible spectrophotometry； Content determining

10.3969/j.issn.1008-3723.2017.01.008

(j)cnki 1008-3723 2017.01.008

2016-12-03

项目来源：辽宁省大学生创新训练项目(201611430016).

刘倩(1993-)，女，辽宁抚顺人，辽宁科技学院生物医药与化学工程学院学生.

R284

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