襄麦冬粗提物抗菌活性初步研究

余海忠 ，孙永林，廖雪义，王海燕

(襄樊学院 化学工程与食品科学学院，湖北 襄樊 441053)

襄麦冬粗提物抗菌活性初步研究

余海忠 ，孙永林，廖雪义，王海燕

(襄樊学院 化学工程与食品科学学院，湖北 襄樊 441053)

以蒸馏水、甲醇、乙酸乙酯为溶剂，提取襄麦冬活性物质，并分别测定提取物对以下5种病原真菌：立枯丝核菌Rhizoctonia solani，灰葡萄孢菌Botrytis cinerea，齐整小核菌Sclerotium rolfsii，终极腐霉Pythium ultimum，尖镰孢菌黄瓜转化型Fusarium oxysporum f. sp cucumber菌丝生长和孢子萌发的抑制作用. 结果表明襄麦冬的三种溶剂提取物对灰葡萄孢菌、终极腐霉、立枯丝核菌的菌丝生长均具有较强的抑制作用，而上述相同浓度的提取物对齐整小核菌、尖镰孢菌黄瓜转化型的生长未表现出明显的抑制效果. 同时，三种溶剂提取物对立枯丝核菌、灰葡萄孢菌、齐整小核菌、终极腐霉、尖镰孢菌黄瓜转化型的孢子萌发均表现出一定的抑制作用. 其中，襄麦冬乙酸乙酯提取物较蒸馏水和甲醇提取物对病原真菌的生长和孢子萌发的抑制效果明显. 乙酸乙酯提取物相对于蒸馏水、甲醇提取物有较好的抑菌效果. 襄麦冬提取物对灰葡萄孢菌、终极腐霉、立枯丝核菌的菌丝生长和立枯丝核菌、灰葡萄孢菌、齐整小核菌、终极腐霉、尖镰孢菌黄瓜转化型的孢子萌发有良好的抑制作用.

襄麦冬；提取物；抑菌活性；菌丝生长；孢子萌发

襄麦冬，即湖北麦冬，拉丁学名Liriope spicata (Thunb.) Lour. var. prolifera Y. T. Ma，为《中华人民共和国药典》(1995年，2000年，2005年版)新增品种山麦冬的基原植物之一，其块根与川麦冬、杭麦冬一样，中药处方均作麦冬同等入药，目前已成为中药麦冬的主流商品，因主产于湖北襄阳欧庙一带而俗称为襄麦冬. 作为道地中药材，襄麦冬已有40多年的栽培历史，常年种植面积在3000ha以上，年产量占全国麦冬产量60%以上，居全国三大麦冬产地之首，单产高于川、杭麦冬，品质优，具有“白、干、净、匀、大”的特点.

对襄麦冬的研究，目前主要集中在GAP栽培技术、种质鉴别、化学成分含量测定及药剂制品的开发[1-7]上，但对其活性物质参与农作物病害的防治鲜见报道. 因此，本实验拟通过对襄麦冬活性物质对几种蔬菜病害的控制展开研究：以襄麦冬块根不同溶剂提取物为供试药液，以立枯丝核菌Rhizoctonia solani；灰葡萄孢菌Botrytis cinerea；齐整小核菌Sclerotium rolfsii；终极腐霉Pythium ultimum；尖镰孢菌黄瓜转化型Fusarium oxysporum f. sp cucumber为靶标病原真菌，采取菌丝生长抑制法和孢子萌发抑制法，测定襄麦冬提取物对上述病原真菌的生物活性，为更加充分、合理的综合利用襄麦冬资源，以及为下一步新型植物源杀菌剂的开发提供理论基础.

1 实验材料

1.1 供试病原真菌

立枯丝核菌R. solani；灰葡萄孢菌B. cinerea；齐整小核菌S. rolfsii；终极腐霉P. ultimum；尖镰孢菌黄瓜转化型F. oxysporum f. sp cucumber. 以上五个菌株由浙江大学生物技术研究所提供，实验室置PDA培养基中培养待用.

1.2 供试植物

襄麦冬L. spicata var. prolifera：采自湖北襄阳欧庙襄麦冬规范化栽培基地.

1.3 实验仪器

旋转蒸发器；电热鼓风恒温干燥箱；电子分析天平；冰箱；微量移液器；具塞试剂瓶；培养皿(φ= 90 mm)；超声波仪；电炉；接种针；搪瓷小托盘；切片机；漏斗；烧杯；新华1号滤纸；剪刀；血细胞计数板；显微镜；盖玻片；无菌毛细滴管；无菌吸管；无菌镊子；米尺；砂布；高压灭菌锅；三角瓶；小刀.

1.4 药品与试剂

吐温-20、甲醇、乙酸乙酯、无水乙醇、葡萄糖、琼脂粉

2 实验方法

2.1 PDA的制备

1)每升水中含200g去皮土豆、20g葡萄糖、20g琼脂粉，不调PH值. 2)200g土豆去皮，切成土豆丁，加几百毫升水煮，待水开后，计时30min，稍凉后用砂布过滤，滤液中加入20g葡萄糖，再加水到1000mL. 3)最后分装到250mL规格的三角瓶中，每瓶放200mL培养基和4g琼脂粉. 121℃高压灭菌20mm. 4)25℃培养. 5)不加琼脂为液体培养基.

2.2 供试真菌的培养

将受试菌株活化后接种于PDA培养基，孵育至有孢子生成.

表1 各种真菌培养条件

2.3 活性物质的提取

将新鲜襄麦冬块根样品洗净沥干后，置于电动恒温干燥箱内60℃烘干至衡重，切片，放于密闭容器中待用.

1)蒸馏水提取 称取襄麦冬切片100g置于1000mL大烧杯中，以1:10的比例加入蒸馏水，55℃水浴提取1h，重复提取3次. 然后滤渣再经超声波处理30min后过滤，合并四次滤液，过滤后置于旋转蒸发器内减压浓缩后得提取物，称重后置于冰箱保存待用.

2)甲醇提取 称取襄麦冬切片100g置于1000mL大烧杯中，加入500mL甲醇溶液，置于通风橱55℃水浴加热1h，重复提取3次，合并滤液，过滤后置于旋转蒸发器内减压浓缩后得提取物，称重置于冰箱保存待用.

3)乙酸乙酯提取 称取襄麦冬切片100g置于1000mL大烧杯中，加入500mL乙酸乙酯溶液，55℃水浴加热回流1h，重复提取3次，合并滤液，过滤后置于旋转蒸发器内减压浓缩后得提取物，称重置于冰箱保存待用.

2.4 提取物活性的测定

2.4.1 襄麦冬提取物对病原真菌菌丝生长的抑制试验[8]

在无菌操作台中，将襄麦冬块根浸膏分别用丙酮配成初始浓度为2g/mL、1g/mL、0.5g/mL、0.25g/mL、0.125g/mL的药液. 将供试菌种平板培养后用7mm的打孔器打出一定数量的菌饼备用. 加热事先已灭菌的PDA，待培养基溶化后，将1mL药液或丙酮(CK)分别与9mLPDA混匀使总体积达到10mL，然后趁热倒入培养皿中制成薄厚均匀的平板. 则处理药液终浓度分别为 0.2g/mL、0.1g/mL、0.05g/mL、0.025g/mL、0.0125g/mL. 然后用接种针小心将菌饼放置在处理培养基和对照培养基上，菌丝面向下,每皿接一块，置于25℃光照培养箱中培养. 接种后24h开始观测，时间间隔为3h，测量菌落直径(十字交叉量取2次,取其平均数). 重复以上步骤5次. 对五种供试菌种分别定时进行测定. 生长抑制率的计算方法:

2.4.2 襄麦冬提取物对病原真菌孢子萌发的抑制试验

用无菌生理盐水冲洗长满孢子的培养基，将孢子冲进锥形瓶中，用纱布滤去杂质. 在6个装有液体培养基的锥形瓶中加入1mL孢子悬浮液，其中5瓶分别加入2mL不同浓度襄麦冬提取物，另1瓶加对照液2mL，达到9：1比例，使药液终浓度分别为0.002g/mL、0.001g/mL、0.0005g/mL、0.00025g/mL、0.000125g/mL，然后在摇床中培养. 孢子萌发(以孢子芽管长度大于孢子短半径者为萌发)后，用无菌水稀释到适当浓度(以10×10低倍镜下，每个视野30～40个孢子为宜)，加到血细胞计数板上，在10×10倍显微镜下观测. 重复以上步骤，对五种供试菌种分别定时进行观测. 孢子萌发抑制率的计算方法:孢子抑制率(%)=(对照萌发数-处理萌发数)/对照萌发数×100%

3 结果与分析

表2 蒸馏水提取物对病原真菌菌落的抑菌效果

3.1 襄麦冬提取物对病原菌生长的抑制

3.1.1 蒸馏水提取物

蒸馏水提取物对灰葡萄孢菌、终极腐霉、立枯丝核菌的抑菌作用较弱，最大抑制率分别是 30.29%、27.73%、24.07%. 对齐整小核菌、尖镰孢菌黄瓜转化型未表现出明显的抑制作用. 同一菌种提取物浓度越高，抑菌作用越明显. 随着稀释比例的增大，抑菌作用逐渐减小.

3.1.2 甲醇提取物

甲醇提取物对灰葡萄孢菌、终极腐霉、立枯丝核菌均有较明显的抑菌作用，最大抑制率分别是49.09%，34.08%，32.37%. 对齐整小核菌、尖镰孢菌黄瓜转化型未表现出明显的抑制作用. 同一菌种提取物浓度越高，抑菌作用越明显. 随着稀释比例的增大，抑菌作用逐渐减小.

表3 甲醇提取物对供试验病原真菌菌丝生长的抑制效果

表4 乙酸乙酯提取物对供试验病原真菌菌丝生长的抑制效果

3.1.3 乙酸乙酯提取物

乙酸乙酯提取物对灰葡萄孢菌、终极腐霉、立枯丝核菌均有明显抑制作用. 最大抑菌率分别是50.41%、39.39%、34.88%. 对齐整小核菌、尖镰孢菌黄瓜转化型未表现出明显抑制作用. 同一菌种提取物浓度越高，抑菌作用越明显. 随着稀释比例的增大，抑菌作用逐渐减小.

3.2 襄麦冬提取物对病原真菌孢子萌发的抑制试验

由表5～7可知，襄麦冬的三种溶剂提取物，对灰葡萄孢菌、立枯丝核菌、终极腐霉、齐整小核菌、尖镰孢菌黄瓜转化型五种真菌的孢子萌发都具有一定的抑制作用. 并且随着提取物浓度的降低，抑制作用也逐渐降低.

3.2.1 蒸馏水提取物

蒸馏水提取物对灰葡萄孢菌、立枯丝核菌、终极腐霉、齐整小核菌、尖镰孢菌黄瓜转化型五种真菌的孢子萌发均具有较弱的抑制作用. 对上述五种病原真菌孢子萌发的抑制率分别是78.57%、70.00%、69.23%、59.26%、48.48%.

表5 蒸馏水提取液对病原真菌孢子萌发的抑制效果

3.2.2 甲醇提取物

甲醇提取物对灰葡萄孢菌、立枯丝核菌、终极腐霉、齐整小核菌、尖镰孢菌黄瓜转化型五种真菌的孢子萌发均具有较明显的抑制作用. 对上述五种病原真菌孢子萌发的抑制率分别是91.30%、90.00%、80.95%、78.95%、63.64%.

3.2.3 乙酸乙酯提取物

乙酸乙酯提取物对灰葡萄孢菌、立枯丝核菌、终极腐霉、齐整小核菌、尖镰孢菌黄瓜转化型五种真菌的孢子萌发均具有明显的抑制作用. 对上述五种病原真菌孢子萌发的抑制率分别是 95.24%、90.48%、89.47%、85.71%、78.26%.

表6 甲醇提取液对病原真菌孢子萌发的抑制效果

表7 乙酸乙酯提取物对病原真菌孢子萌发的抑制试验

4 小结

为了探究湖北道地药材襄麦冬在农业抑菌方面的潜力，本文首次室内测定了其不同溶剂提取物对病原真菌菌丝生长和孢子萌发的影响. 结果表明：1)三种溶剂提取物对灰葡萄孢菌、终极腐霉、立枯丝核菌的菌丝生长均具有较强的抑制作用，而上述相同浓度下的提取物对齐整小核菌、尖镰孢菌黄瓜转化型的生长未表现出明显的抑制效果. 2)三种溶剂提取物对立枯丝核菌、灰葡萄孢菌、齐整小核菌、终极腐霉、尖镰孢菌黄瓜转化型的孢子萌发均表现出一定的抑制作用. 其中，无论是对菌丝生长还是孢子萌发，乙酸乙酯提取物都较蒸馏水和甲醇提取物的抑制效果明显. 与另外二种溶剂相比乙酸乙酯极性最小，因此，笔者推测此种现象是否与活性成分的极性有关.

本文对襄麦冬提取物抑菌活性进行了初步测试，显示了其可观的杀菌潜力，为开发新型天然杀菌剂提供了新的思路，对襄麦冬的综合开发利用亦有着重要意义. 但是，本实验只采用了少数几种微生物作为靶标病菌，襄麦冬活性成分到底具有多宽的杀(抑)菌谱？最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)又各是多少？襄麦冬提取物是混合物，究竟是哪一种或几种其它成分参与抑菌？活性成分对微生物的抑制作用机制又是怎样？活性成分的稳定性(热稳定性、光稳定性、抗氧化性等)又如何？以上问题都有待进一步深入研究.

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[3] 吴 弢, 余伯阳, 程志红, 等. HPLC-ELSD法测定湖北麦冬中主要皂苷的含量[J]. 中草药, 2000, 31(3): 175-176.

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Antifungal Activity of Crude Extracts of Liriope spicata (Thunb.) Lour. Var. prolifera Y. T. Ma

YU Hai-zhong, SUN Yong-lin, LIAO Xue-yi, WANG Hai-yan
(School of Chemical Engineering and Food Science, Xiangfan University, Xiangfan 441053, China)

The study aims to provide theory basis for the development and improvement of the utinization rate of Liriope spicata (Thunb.) Lour. var. prolifera Y. T. Ma. The active substances of Liriope spicata (Thunb.) Lour. var. prolifera Y. T. Ma were extracted respectively by using distilled water, methanol and ethyl acetate as solvents, and the inhibitory activity of the extracts against mycelia growth and spore germination were measured against the five pathogenic fungi, which were Rhizoctonia solani, Botrytis cinerea, Sclerotium rolfsii, Pythium ultimum, Fusarium oxysporum f.sp cucumber. whereas the extracts by three different solvents had significant inhibitory activity against the mycelia growth of Botrytis cinerea, Pythium ultimum, Rhizoctonia solani, they had little such activity against the mycelia growth of Sclerotium rolfsii and Fusarium oxysporum f.sp cucumber. And they had certain inhibitory activity against the spore germination of all the five fungi. Among which, the inhibitory activity of the extract by ethyl acetate against the mycelia growth and spore germination was significantly higher than the other two ones. It can be concluded that the extracts by ethyl acetate had better antifungal activity than the other two ones. And the extracts had significant inhibitory activity against the mycelia growth of Botrytis cinerea, Pythium ultimum, Rhizoctonia solani, along with their activity against the spore germination of all the five fungi.

Liriope spicata (Thunb.) Lour. var. prolifera Y. T. Ma; Extracts; Antifungal activity; Mycelia growth; Spore germination

S482.2

A

1009-2854(2010)05-0020-05

2010-04-08

湖北省教育厅优秀中青年人才项目(Q20082504); 襄樊科技局科技攻关项目(200517); 湖北省高等学校产学研项目(CD092501); 襄樊学院重大科研项目(Zdky200905)

余海忠(1976— ), 男, 湖北枣阳人, 襄樊学院化学工程与食品科学学院讲师.

徐 杰)