Ifenprodil对自噬的调控机制及其在帕金森病中的作用

赵昕昱,田付港,于 昕

(烟台大学药学院,烟台大学新型制剂与生物技术药物研究山东省高校协同创新中心,分子药理和药物评价教育部重点实验室(烟台大学),山东 烟台 264005)

帕金森病(Parkinson’s disease,PD)的主要病理特征为中脑黑质致密部(substantial nigra pars compacta,SNC)多巴胺能神经元退化缺失。近些年兴奋性氨基酸(Excitatory amino acid,EAA)毒性假说观点在PD发病因素中成为热议[1-2]。N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartic acid, NMDA)受体作为谷氨酸(Glutamic acid,Glu)的主要受体,它的激活对突触上正常信号传导以及细胞的正常生理功能调节具有重要的作用。OLNEY[3]研究表明,突触间隙间Glu浓度过高,会过度激活突触后膜上NR2B受体,离子门控通道过度开放,导致胞外大量Ca2+内流,内质网上Ca2+释放,CaMKⅡ介导的钙离子信号在胞内异常传递,造成胞内Ca2+大量聚集,出现Ca2+超载,损伤线粒体,抑制线粒体的自噬清除能力,诱发神经元死亡。临床上常用左旋多巴(Levodopa,L-DOPA)来治疗PD,该药为一种体内合成的多巴胺前体物质[4],其给药引起的“开关效应”在患者PD后期会引发严重的运动并发症(Levodopa-induced Dyskinesias,LID),严重影响生活质量。因此，新的治疗靶点和治疗方式是亟待解决的问题。

艾芬地尔(Ifenprodil,图1)是一种NMDA受体选择性拮抗剂,对NMDA受体NR2B的选择性约是NR2A的400倍[5]。在对NMDA受体为靶点研究EAA在脑缺血致梗死的实验中表明,Ifenprodil可以通过调节NMDA受体,有效降低梗死范围,改善神经功能[6]。目前有关Ifenprodil治疗PD的已知相关研究中因其研究结果尚未完全明朗,并未应用于PD的临床用药。

图1 Ifenprodil结构式

本实验以Ifenprodil为受试用药,以L-DOPA作为阳性对照,探究Ifenprodil对PD的缓解是否与降低Glu介导的EAA毒性有关,并在NMDA受体以及细胞自噬方向进行机制探讨,为临床药物的选择提供理论基础。

1 实验材料

1.1 细胞株与实验动物

人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y细胞株由中国科学院干细胞库提供,所需的培养基为DMEM完全培养基(内含10%胎牛血清,青霉素100 U/mL,链霉素100 U/mL),置于5%CO2、饱和湿度、37 ℃恒温培养箱内培养。1～2 d更换培养液,培养至单层细胞汇合,传代培养。

SPF级Sprague-Dawley (SD) 大鼠,雄性,24只,体重180～200 g,购自济南朋悦实验动物繁育有限公司,动物许可证号SCXK(鲁)2019-0003,质量合格证流水号:1107261911003748。所有实验动物均在温度23.05±2.00 ℃,相对湿度为43.4%～68.5%,人工照明,12 h/12 h明暗交替的条件环境适应7 d,期间自由饮食饮水。本研究经过烟台大学动物伦理委员会审查批准。

1.2 药品与试剂

6-Hydroxydopamine hydrobromide(6-OHDA)批号:MKBX4996V(sigma);Ifenprodil批号:098M4086V(MCE);Actin抗体(小鼠单抗)、BCA浓度测定试剂盒(增强型)、酶标山羊抗兔IgG、山羊抗鼠IgG(碧云天生物技术公司);GT Vision TMIII型免疫组化检测试剂盒(含DAB)(上海基因科技股份有限公司)NR2B抗体、NR2A抗体、TH抗体(Abcam);lc3b抗体、beclin-1抗体、p62抗体、bax抗体、bcl-2抗体(CST)。

1.3 主要仪器

CO2培养箱(日本SANYO公司);离心机(美国Beckman公司);全自动化学发光成像凝胶成像系统(北京赛智创业科技有限公司);酶标仪(美国伯腾仪器有限公司);OLYMPUSIX73倒置荧光显微镜(北京奥林巴斯有限公司);冰冻切片机(中国赛默飞世尔科技有限公司);Vectra3定量病理成像分析系统(上海珀金埃尔默企业管理有限公司)。

2 实验方法

2.1 Glu对细胞损伤实验

2.1.1 MTT确定Glu造模时间、浓度 取对数生长状态良好的SH-SY5Y细胞,1.2×104个·mL-1密度接种96孔板,待细胞贴壁生长24 h后,加入不同浓度以空白DMEM培养基配制的Glu溶液(50、40、30、20、10、5 mmol·L-1),并加入总体系体积0.1%的DMSO助溶。对照组换用空白DMEM培养基培养。置于37 ℃、5%CO2恒温培养箱,分别培养2、6、24 h,加入5 g·L-1MTT,每孔20 μL,37 ℃、5%CO2孵育2 h,弃去培养基,每孔加入150 μL DMSO,水平震荡机振荡15 min,酶标仪562 nm处测定吸光度(A)。

2.1.2 Ifenprodil对细胞的保护作用 取对数生长良好的SH-SY5Y细胞,8×103个·mL-1的密度接种96孔板,待细胞贴壁生长24 h后,对细胞进行药物处理,置于37 ℃、5%CO2恒温培养箱培养,利用MTT法测定细胞生存率。

2.1.3 Western bolt检测细胞蛋白表达 取对数生长良好的SH-SY5Y细胞平均传代,待细胞贴壁生长24 h后,对细胞进行药物处理,置于37 ℃、5%CO2恒温培养箱培养,收集细胞,提取蛋白。具体操作步骤严格按照提取试剂盒说明。进行蛋白电泳,显影。

2.2 单侧6-OHDA损伤的PD大鼠实验

2.2.1 动物模型制备及筛选 实验之前对动物进行行为学筛查，根据实验要求对大鼠进行分组,每组6只,根据课题组前期探索确定给药剂量。PD大鼠模型的建立、具体分组与给药见图2。

图2 PD模型以及分组给药

对大鼠施全麻(2%戊巴比妥钠,0.3 ml/100 g,i.p),依照大鼠立体定向脑图谱[7]进行注射,注射位置:前囟后4 mm,矢状缝左1.65 mm,硬膜下8 mm。实验组给与4 μL 6-OHDA(1 mg/mL溶于含0.1%生理盐水配制的VC溶液中),对照组注射4 μL含0.1%生理盐水配制的VC溶液。注射速度0.5 μL/min,留针8 min,缝合处理创面。连续一周,皮下注射氨苄青霉素10万U。术后大鼠需精心饲养,注意营养补充,勤换垫料。3周后APO(0.5 mg/kg, i.p.)诱导大鼠对侧旋转行为,筛选模型,旋转大于50 r/10 min的大鼠,视为造模成功。

2.2.2 行为学检测 对照组(生理盐水0.01 mL/kg,1次/d)、模型组(生理盐水0.01 mL/kg,1次/d)、L-DOPA组(25 mg/kg,1次/d)、Ifenprodil组(2.6 mg/kg,1次/d)分别给予药品进行治疗,于第2天和第5天进行行为学检测。APO诱导旋转:各组大鼠在给药30 min后,给予APO(2 mg/kg, i.p.);3 min后,记录大鼠对侧旋转圈数。圆筒实验:各组大鼠给药30 min后,置于透明有机玻璃制作的圆筒(15 cm×20 cm: D×H),30 min,全程录像；记录每次大鼠直立状态下,上肢接触圆筒壁的时长(包括左上肢接触时长、右上肢接触时长、双侧上肢接触时长)，利用公式[8]计算不同组别大鼠行为的不对称指数：

不对称指数=(同侧触壁次数+1/2双侧触壁次数)/(同侧触壁次数+对侧触壁次数+双侧触壁次数)。

2.2.3 Western Blot法检测纹状体蛋白表达 生理盐水心脏灌注,取脑。冰上分离纹状体适量裂解液研磨组织,具体操作步骤严格按照BCA蛋白提取试剂盒说明,50 μg的上样质量,进行上样,电泳,采用ImageJ软件进行图片分析,以目的蛋白条带与内参的积分光密度(IDO)之比,表示蛋白的相对表达水平。

2.2.4 免疫组化法检测大鼠黑质TH阳性细胞的表达 依次用生理盐水、4%多聚甲醛心脏灌注,取脑,蔗糖梯度(10%,20%,30%)/24 h脱水固定,冠状冰冻切片(10 μm),按照免疫组化检测试剂盒步骤进行染色,Vectra3定量病理成像分析系统拍摄图片,Image J软件分析TH阳性神经元数量。

2.3 统计学方法

3 实验结果

3.1 Glu对细胞损伤实验

3.1.1 造模条件 如图3所示,Glu为30 mmol·L-1时,SH-SY5Y细胞的生存率低于80%,处理6 h时,细胞损伤达到稳定水平。

与对照组(0浓度)相比,*P < 0.05,

3.1.2 Ifenprodil对细胞的保护作用 Ifenprodil对细胞的治疗作用具有一定的浓度依赖(图4),并且在Glu损伤前(A组)后(B组)加入Ifenprodil对细胞都具有一定的保护作用,且不同处理之间没有统计学差异。

图5结果所示,与Glu损伤组相比,Ifenpeodil组bcl-2/bax比值增加,lc3b和beclin-1含量增加,p62含量降低,且呈剂量依赖性,说明在一定浓度范围内,Ifenprodil可拮抗Glu诱导的细胞自噬抑制作用,保护受损伤细胞。

与Glu损伤组相比, *P < 0.05,**P<0.01。

与Glu损伤组相比, *P < 0.05,**P<0.01;与A组相比,#P<0.05。

3.2 Ifenprodil治疗6-OHDA损伤的PD大鼠实验

3.2.1 动物模型筛选和行为学检测 如图6(a)所示,对大鼠进行APO诱导旋转实验,与对照组比较,单侧损伤6-OHDA大鼠产生明显对侧旋转行为(P<0.01),提示模型成功。

与模型组相比,*P<0.05,**P<0.01;与L-DOPA组相比,#P<0.05。

如图6(b)大鼠旋转行为结果所示:对照组均未见旋转行为,模型组与L-DOPA组、Ifenprodil组相比,差异均具有统计学意义(P<0.01),且与L-DOPA组相比,Ifenprodil组旋转圈数降低(P<0.05),说明Ifenprodil可减少由APO诱导产生的旋转行为。

如图6(c)大鼠圆筒实验结果所示:与模型组相比,L-DOPA组和Ifenprodil组差异均不具有统计学意义,未显示出明显的行为改善作用。

3.2.2 Western Blot实验 实验结果表明(图7):与模型组相比，L-DOPA组和Ifenprodil组bcl-2/bax的表达量增加、beclin-1的表达量增加、p62的表达量降低,Ifenprodil组lc3b表达量增加,均具有统计学意义(P<0.05),提示Ifenprodil是通过缓解自噬抑制来发挥对多巴胺神经元细胞的保护作用。对比NMDA受体相关亚基的表达,与模型组相比,Ifenprodil组NR2A、NR2B的表达量均显著下降(P<0.05),说明Ifenprodil对6-OHDA-PD大鼠的治疗作用可能是通过降低膜上NR2B的含量发挥作用的;与L-DOPA组相比,Ifenprodil组NR2B表达量明显降低(P<0.05), 说明Ifenprodil给药对抑制6-OHDA大鼠NR2B的兴奋性表达具有更好的抑制作用。

3.2.3 免疫组织化学实验 实验结果表明(图8):与对照组相比,模型组的TH阳性神经元数目显著减少(P<0.05),与模型组相比,L-DOPA组、Ifenprodil组神经元数目均明显增多(P<0.05),但L-DOPA组与Ifenprodil组之间差异不具有统计学意义,表明Ifenprodil对多巴胺神经元具有一定的保护作用。

4 讨 论

NMDA受体对神经元信号的传导具有重要的作用[9],研究发现NMDA受体过度兴奋可能是导致PD的一项重要原因[10]。基于以上理论,本研究利用NMDA受体拮抗剂Ifenprodil在体内体外两方面探讨NMDA受体拮抗剂治疗PD的作用机制。

人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y具有成熟神经元形态和生化特征,可用于神经科学研究。本实验采用Glu损伤SH-SY5Y细胞模拟PD患者DA神经元的自噬障碍,并给予NMDA受体拮抗剂Ifenprodil治疗,观察其对自噬的调控机制。实验结果表明,Glu可对细胞产生损伤作用,降低细胞的生存率,抑制细胞对照自噬作用,Ifenprodil治疗可增强细胞的存活率,并增强自噬蛋白lc3b和 beclin-1的表达,降低p62的表达,上调 bcl-2/bax的比值发挥对细胞的保护作用。Ifenprodil可以缓解Glu导致的细胞死亡并改善细胞自噬障碍。

6-OHDA是儿茶酚胺的羟基化衍生物,是一种可导致多巴胺神经元变性的神经毒剂,对动物脑内黑质区定向注射6-OHDA可以缓慢损伤多巴胺神经元,因而已经被用来模拟PD的慢性病程[10-11]。本实验采用6-OHDA制作PD大鼠模型,以L-DOPA作为阳性对照,在动物水平上观察Ifenprodil的抗PD治疗作用,并观察其对自噬的调控机制。

与模型组相比,*P<0.05,**P<0.01;与L-DOPA组相比,#P<0.05。

与模型组相比,*P<0.05,**P<0.01;与L-DOPA组相比,#P<0.05。

在旋转行为实验中,Ifenprodil表现出明显的行为学改善作用,但在圆筒实验中未表现出行为学改善作用,可能与药物同时作用于皮层、扣带回、海马等脑区NMDA受体[12],掩盖了纹状体相关行为学表现有关。对黑质致密部TH阳性的情况以及纹状体部分相关蛋白表达进行分析,与模型组相比,Ifenprodil组神经元数目均明显增多,说明Ifenprodil可对受损的多巴胺神经元产生保护作用;Ifenprodil组bcl-2/bax的表达量增加,p62的表达量降低,beclin-1的表达量增加,说明Ifenprodil可对纹状体细胞产生保护作用。与L-DOPA组相比,Ifenprodil组神经元数目未表现出显著性差异,说明Ifenprodil给药对受损多巴胺神经元可以达到与L-DOPA相似的保护效果;与L-DOPA组相比,Ifenprodil组lc3b表达量显著增加,推测Ifenprodil对6-OHDA-PD大鼠神经元的保护作用是通过调节自噬作用来实现,而L-DOPA对6-OHDA-PD大鼠神经元的保护作用并不是通过调节自噬作用来实现。在NMDA受体相关亚基的表达中,与模型组相比,Ifenprodil组NR2A的表达量降低,Ifenprodil组NR2B表达量降低,表明Ifenprodil对6-OHDA-PD大鼠的治疗作用可能是通过改变膜上NMDA受体不同亚基的丰度,降低膜上NR2B的含量,减弱其介导的下游信号而发挥作用的;与L-DOPA组相比,Ifenprodil组NR2B表达量显著降低,推测L-DOPA组NR2B的过表达可能与L-DOPA引起的LID有关,而Ifenprodil给药可避免使动物产生LID。

5 结 论

本研究结果表明,Ifenprodil可以通过改变膜上NMDA受体亚基的表达,来拮抗Glu的兴奋性毒性作用,从而进一步调节细胞内部自噬反应,发挥对神经元的保护作用,其对6-OHDA-PD大鼠黑质神经元的保护作用基本与L-DOPA相当,但不会引起LID。