秀丽隐杆线虫抗铜突变体的筛选及SNP定位

宋少娟，郭亚平，张学尧，张建珍，马恩波

1. 山西大学应用生物研究所，太原 030006；

2. 山西大学生命科学学院，太原 030006

秀丽隐杆线虫抗铜突变体的筛选及SNP定位

宋少娟1，郭亚平2，张学尧1，张建珍1，马恩波1

1. 山西大学应用生物研究所，太原 030006；

2. 山西大学生命科学学院，太原 030006

铜在有机体代谢过程中发挥着重要作用，但过量可产生毒害效应。文章以秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)为模式生物，寻找多细胞生物中铜代谢调节的关键基因。采用甲基磺酸乙酯(EMS)诱变秀丽隐杆线虫，通过100 000个杂合基因组的筛选得到两个抗铜突变体ms1和ms2。在筛选培养基上野生型停止发育，而抗铜突变体则可发育到成虫，且抗铜性状能稳定遗传。与N2的回交实验表明，ms1的抗铜表型可能由单基因隐性突变导致，ms2的抗铜表型消失，可能是由多基因突变引起。以 CB4856和 ms1作为亲本，构建了F2群，经SNP定位，确定ms1突变位点位于染色体II(LGII)上，进一步对LGII染色体上的8个SNP标记进行分析，将ms1的突变位点定位在LGII:-6附近。秀丽隐杆线虫抗铜突变体ms1的筛选和定位可为深入研究线虫铜代谢及调控的分子机制提供实验依据。

秀丽隐杆线虫；正向遗传筛选；抗铜；突变体；SNP定位

铜在生物体广泛存在且具有重要的生理功能，生物体主要通过铜转运蛋白、铜分子伴侣和小分子螯合剂等共同调节铜的稳态。在哺乳动物中，细胞外的Cu2+由steap2和Dyctb还原为Cu1+，通过hCTR1 (Human copper transporters 1)和DMT1(Dvalent metal transporter 1)转运到细胞内，之后可参与到以下代谢途径中：(1)与Cox17(Cytochrome c oxidase)结合传递给线粒体内膜上的细胞色素C氧化酶，参与到呼吸链中；(2)与CCS(Copper chaperone for SOD1)结合传递给 SOD(Superoxide dismutase)缓解氧化压力；(3)与Atox1(Antioxidant 1 copper chaperone)结合呈递给ATP7A(Copper-transporting ATPase 1)排出胞外；(4)与金属硫蛋白 MT(Metallothionein)结合降低其毒害作用[1]。这些铜代谢途径障碍则会引发人的遗传疾病，主要包括 Menkes综合征和肝豆状核变性。Menkes综合征是肠道上皮基底膜ATP7A失活，导致机体不能正常从食物中吸收 Cu2+而引起严重的铜缺乏；肝豆状核变性则是 ATP7B(P-type ATPase)失活导致机体铜排出障碍而引起严重的铜中毒[2]。在细菌中组成型胞外多糖可以非特异性地结合胞外铜离子，减轻其对细菌的毒性[3]，另外cue(铜排出系统)、cus(胞质铜解毒系统)、pco(抗铜质粒)和 cop(抗铜质粒)系统能够特异性地识别铜离子并缓解其毒性[4]；在植物中铜代谢还受miR398的调节[5]。目前，多细胞动物中抗铜突变体的研究报道还很少。

秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)为重要的模式生物，已广泛应用于分子生物学、遗传学、发育生物学和神经生物学等方面的研究[6]。线虫铜代谢基因高度保守，其基因组中有10个铜转运蛋白(CTR-like)、2个铜分子伴侣(CUTC-1、CUC-1)和 1个铜排出蛋白(CUA-1)[7～11]。将cutc-1进行 RNA干扰后可增加线虫对铜的敏感性[8]。过表达半分子腺苷三磷酸结合盒转运蛋白 hmt-1可减轻过量铜的毒性[12]。长寿基因daf-2和age-1缺失也可增强对铜的抗性[13]。本实验室先前的研究表明，过量铜能够延迟线虫的生长发育[14]。但迄今为止，参与调节铜代谢及调节的分子机制尚不完全明确。

1974年Brenner发现EMS化学诱变剂具有很高的诱变效率[15]，且突变体的基因可以定位克隆，这也是正向遗传筛选的最大优点[16]。之后经过不断改进，利用化学诱变剂EMS和基因定位对线虫进行大规模正向遗传学筛选，已成为基因功能研究的重要手段[17,18]。目前，在基因定位过程中，分子标记已经逐步取代了传统的表型观察。在分子标记的发展过程中，单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism, SNP)是继随机扩增多态性 DNA标记(Random amplified polymorphic DNA, RAPD)[19]、限制性片段长度多态性(Restricted fragment length polymorphism, RFLP)和微卫星标记(Simple sequence repeat, SSR)之后的又一种新的分子标记，可检测同一物种不同个体间染色体上单个碱基的变化，通常呈双等位基因多态性[20]，目前已成功应用于突变体的筛选和基因定位[21～23]。

本文将秀丽隐杆线虫进行大规模化学诱变，正向遗传筛选抗铜突变体，并采用SNP进行初步定位，为突变体基因的定位和克隆及研究线虫铜代谢调控的分子机理提供基础资料和理论模型。

1 材料和方法

1.1 线虫培养和同步化

线虫培养采用NGM培养基(1.7% 琼脂、2.5 g/L蛋白胨、25 mmol/L NaCl、5 mg/L胆固醇、25 mmol/L KPO4缓冲液pH 6.0(108.3 g KH2PO4、35.6 g K2HPO4，加水到1 L)、1 mmol/L MgSO4、1 mmol/L CaCl2)，于 20℃喂食大肠杆菌 OP50[16]。实验中用到的英国源线虫N2和夏威夷源线虫CB4856均由中国科学院遗传与发育生物学研究所杨崇林课题组提供，以野生型N2为母本进行诱变和筛选，CB4856用于SNP定位。线虫同步化按照 Wormbook的标准方法：用M9缓冲液(3 g KH2PO4、6 g Na2HPO4、5 g NaCl、1 mol/L MgSO41 mL，加水到1 L)收集怀卵的成虫，2000 r/min离心1 min，弃上清，加入1 mL bleach buffer(0.5% NaClO、0.5 mol/L NaOH)，涡旋震荡5 min，用M9清洗5～6次，得到卵，孵化后为同步化的L1[24]。

1.2 筛选培养基

卵放在加入不同浓度CuSO4的NGM培养基(0、0.025、0.05、0.075、0.1、0.125、0.15、0.2、0.25、0.4、0.5、0.6、0.8、1、1.2 mmol/L)上，连续观察4 d，记录能够发育到成虫的比例，每个浓度 3个重复。导致所有卵均不能发育到成虫的浓度作为筛选浓度，并据此配制成含铜的筛选培养基。

1.3 诱变

用EMS按照标准方法诱变N2[18]。配制0.2 mol/L EMS母液，15 mL离心管加入2 mL M9 buffer和0.2 mL EMS母液；取另外一支15 mL离心管，M9 buffer 清洗同步发育的N2 L4线虫3～4次，留2 mL 液体，加入第一支15 mL离心管中。室温50 r/min培养4 h后离心清洗。取沉淀0.2～0.5 mL 放置在NGM培养基上，2 h后，5只P0分一个板，共分100个板，自交两代。

1.4 筛选

收集诱变后的F2卵，放在含铜的筛选培养基上，4～7 d后发育为成虫的，挑出并单独放在NGM培养基上扩大培养。之后收集500～1000枚卵于含铜筛选培养基上，若有＞10%个体能够在4～7 d后发育为成虫，则为抗铜突变体，且抗铜特性能够稳定遗传。实验共筛选了约100 000个单倍体基因组。

1.5 回交

对筛选到的突变体进行回交，即突变体雄虫与野生型P0雌雄同体杂交，挑选杂交后代F1，每板1只，共6～10只，扩大培养F2，F3卵放在筛选培养基上，筛选纯合突变体，进行下一次回交。4次回交完成后则得到遗传背景较为单一的抗铜突变体，且可能为点突变。

1.6 DNA提取和PCR扩增

线虫DNA提取采用蛋白酶K法[25]，将50只线虫放于50 μL线虫裂解液(20 mmol/L Tris pH 7.5、50 mmol/L EDTA、200 mmol/L NaCl、0.5% SDS、100 μg/mL蛋白酶K)中，液氮速冻，65℃ 1 h，95℃灭活15 min，作为PCR模板。PCR 扩增采用20 μL体系：10×PCR buffer (Mg2+free)2 μL，25 mmol/L MgCl22 μL，0.1 mmol/L dNTP 0.5 μL，10 μmol/L引物 0.5 μL，5 U/μL taq 酶 0.2 μL，DNA模板2 μL，用ddH2O补齐到20 μL。扩增程序：94℃ 5 min；94℃ 15 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，40个循环；72℃8 min。Dra I(NEB)15 μL体系酶切，琼脂糖凝胶电泳检测。

1.7 SNP定位染色体

本文采用 SNP分子标记基于自由组合定律对ms1进行了初步定位(图1)。CB4856和N2品系相比，各条染色体有众多的SNP差异。CB4856与突变体杂交的F1产生配子时，来自父母本的非同源染色体将发生自由组合。在抗铜表型的F3中，与突变位点在同一条染色体上的SNP，发生自由组合的概率低，而其他染色体则符合自由组合定律。具体方法为：用CB4856与突变体杂交，挑出约20～40个F1杂合子，每个F1单独培养，待其成熟产卵时，加入bleach buffer，收集F2卵，在筛选培养基上挑出正常生长发育的线虫扩大培养，得到突变位点纯合子F2系。参考Davis方法[23]找到染色体中部能被 Dra I(TTT^AAA)识别切割的SNP位点，合成引物(表1)，进行PCR扩增，对PCR产物进行酶切分析，确定突变基因的染色体定位。CB4856的 SNPs经网站查询(http://genome. wustl.edu/services/c-elegans-snpdata/)。

图1 SNP染色体定位策略示意图(参考Wormbook[24]，略做修改)P0：父本为夏威夷(Hawaii)源线虫(CB4856)，母本为突变体，细线为N2源片段，粗线为CB4856源片段。杂交后，如果突变基因与SNP标签不连锁，则F2代中CB4856源片段和N2源片段约为1：1。如果突变基因与SNP标签连锁，则F2代中 N2源片段超过2/3。

表1 染色体定位所需SNP多态性标签[22]

图2 SNP染色体内定位策略示意图(参考Wormbook[24]，略做修改)P0：父本为 CB4856，母本为突变体。细线为 N2源片段，粗线为CB4856源片段。杂交后，ms1突变基因以外的部分可能被交换成CB4856源片段，越接近突变基因的部分发生交换的概率越低，因此在ms1附近区域进行SNP酶切时呈现N2源酶切带型的概率越高。

1.8 SNP染色体内定位

确定突变体所在的染色体后，为了进行染色体内的初步定位，基于连锁交换定律，采用图2所示策略，在相应的染色体区段寻找新的 SNP标签(表2)。图2中的两个标识SNP标签被染色体远端的SNP标签替代，离突变位点越近，被交换的概率越低，从而确定基因的遗传图谱位置[22]。

2 结果与分析

2.1 不同浓度CuSO4对线虫生长发育的影响

图3A显示对照组在4 d内发育到成虫，处理组随着铜浓度的提高，线虫生长发育受阻，停留在L1幼虫期直至死亡，一旦L1线虫蜕皮到L2阶段，可缓慢发育到成虫，同时随着CuSO4浓度的增加，线虫能够发育到成虫的数量明显降低。当CuSO4浓度达到0.6 mmol/L时，可完全阻止野生型线虫所有的卵发育到成虫，在更高浓度铜离子处理下，线虫全部停留在L1幼虫阶段。结果表明，线虫停止发育的半有效剂量EC50约为0.52 mmol/L，全有效剂量EC100为0.6 mmol/L。

表2 II号染色体SNP多态性标签[22]

图3 不同浓度CuSO4对线虫生长发育的影响A：线虫卵的存活率和成虫率随着铜浓度的升高而降低，当CuSO4浓度达到0.6 mmol/L时线虫停止发育；B：突变体ms1在0.6～1.2 mmol/L CuSO4浓度下成虫率均显著高于野生型。

2.2 正向遗传筛选线虫抗铜突变体

本文选择0.8 mmol/L CuSO4的NGM培养基作为筛选培养基，经EMS诱变筛选后，得到2个抗铜突变体，分别命名为ms1和ms2。ms1回交4次，后代均表现出稳定的抗铜表型，表明ms1的抗铜表型是由基因突变引起的(图 4)。ms2在回交过程中，抗性消失，可能是多基因突变引起的。

图4 ms1在筛选培养基上发育到成虫A：N2 在普通的NGM上96 h后发育到成虫；B：N2在含0.8 mmol/L CuSO4的筛选培养基上停止发育；C：ms1在筛选培养基上96 h后发育到成虫。比例尺为50 μm。

采用不同浓度CuSO4处理ms1和N2(图3B)，共设11个浓度，每组3个重复，每一个样本约100个卵，96 h后，观察记录发育到成虫的线虫数量，进一步分析ms1对铜的抗性水平。结果显示，N2在0.8 mmol/L CuSO4筛选培养基上96 h后仍然停留在L1阶段，而ms1在相同浓度下能够正常生长发育。在0.6～1 mmol/L CuSO4浓度下，ms1的成虫率从76%降到17%，每一组都比相同浓度下野生型N2的成虫率显著性增高(P＜0.05，t-test)。N2的EC50约0.5 mmol/L，而ms1的EC50约0.8 mmol/L，是N2的1.6倍(图3)。ms1对铜有显著抗性(图3B)，同时观察到ms1在正常 NGM培养条件下其形态结构和运动方式没有明显变化。

2.3 ms1突变基因的染色体定位

将CB4856的卵放在筛选培养基上培养，100%的线虫停留在 L1阶段，表明铜在筛选培养基上对CB4856发育的抑制效应与野生型N2相似，突变体的抗铜表型可以从CB4856的背景中分离出来。

用CB4856雄性与ms1杂交，得到F1杂合子。F2卵放于筛选培养基上，挑出正常生长到成虫的抗铜纯合子，扩大培养。这些F2系线虫的突变位点是纯合子，因此所在染色体的SNP标签绝大多数来源于N2源，其他染色体的SNP标签则符合自由组合定律(图5)。本文分离到36个单独的抗铜纯合子，提取DNA，按顺序编号用于分析。

选取染色体中间位置的 SNP标记(图 5)，分析每个染色体 SNP分子标记基因型(表 1)。对每一个F2系的DNA进行PCR、酶切和电泳分析(图5)，计算N2源片段纯合子的概率。结果显示16个F2系，染色体II(LGII)中全部含有N2源片段，只有3个含有CB4856源片段，即在染色体II染色体中间位置约有91%的N2源片段，染色体I、III、IV、V、X染色体上约有47%～75%的N2源片段(图5)，因此确定ms1突变位点位于染色体II上。

2.4 ms1突变基因的遗传位置

采用图2所示策略，选取新的SNP标签。由于ms1位于染色体II上，所以在该染色体上重新选择了8个SNP标签，覆盖-18～+22的遗传距离(表2)。酶切鉴定结果如表3所示，当酶切进行到标签-6时交换概率降为1，据此确定ms1位于遗传图谱LGII:-6附近。

图5 ms1染色体定位共检测了32条染色体，其中LGI染色体有21个N2源片段；LGII染色体有29个N2源片段；LGIII染色体有24个N2源片段；LGIV染色体有20个N2源片段；LGV染色体有21个N2源片段；LGX染色体有19个N2 源片段。

表3 SNP酶切定位鉴定结果

3 讨 论

铜代谢是生物体基本的生理代谢途径[1]，铜中毒可引起人体食欲减退、精神沉郁、呕吐、腹泻、苍白无力、呼吸困难、颤抖、死胎和流产等，严重危害人体健康[2]。全面了解参与铜代谢基因的分子机制，例如铜如何被生物体吸收，穿过细胞膜进入细胞；生物体如何在铜过量和缺乏时启动相应的调节机制等，有助于深入探索这一复杂的代谢过程。本文以秀丽隐杆线虫为研究对象，采用正向遗传学方法，通过对全基因组进行随机化学诱变，筛选到与铜代谢相关的突变体。

线虫突变体在筛选培养基上的正常生长发育与野生型停止生长发育的表型对于筛选、回交和基因定位至关重要。本文通过观察分析不同浓度 CuSO4对野生型线虫生长发育的影响，发现当浓度达到0.6 mmol/L时N2线虫全部停止发育(图2)，为了便于后续实验的进行，本文确定筛选培养基的浓度为 0.8 mmol/L CuSO4，在此浓度下所有的卵均不能正常发育到成虫。

由于线虫是雌雄同体，L4是生殖细胞成熟时期，故采用EMS处理L4线虫[16]。EMS可直接渗入线虫体内烷基化碱基，原始生殖细胞的DNA复制时发生错配，导致生殖细胞点突变发生，主要是G:C变为A:T。EMS诱变后，自交，收集F2卵在筛选培养基上进行突变体的初步筛选和分类，从而可有效地发现隐性突变基因的表型[18]。确认抗铜表型后，根据孟德尔遗传规律，对F3代回交，不仅可方便地区分出多基因遗传缺陷、单基因遗传缺陷和耐受性增加，还可以消除诱变过程中产生的随机无效突变。通过上述方法，本文筛选得到抗铜突变体ms1和ms2。其中ms2在回交过程中，抗铜表型消失，其原因可能是EMS同时导致线虫基因组多处点突变，在回交的过程中这些基因分离，导致抗铜表型消失。

突变体的简单快速定位作为正向遗传筛选的主要手段，在研究基因功能方面具有重要意义。基因定位的经典方法是利用突变基因(控制特定表型)与遗传标记的连锁分析，SNP属于第三代分子标记。秀丽隐杆线虫全基因组测序完成，由于地理隔离和遗传漂移，夏威夷线虫(CB4856)和英国线虫(N2)平均每隔1000个碱基就有1个SNP位点[23]，也为采用单核苷酸多态(SNP)分子标记进行突变体定位提供了有利条件。与传统定位方法相比，线虫SNP分子标记定位具有如下优点：(1)SNP标签多位于基因组无功能区，因此不会干扰所要观察的表型；(2)目前已发现了大量的 SNP标签(http://genome.wustl. edu/services/c-elegans-snpdata/)，为进一步的深入研究提供了条件；(3)线虫SNP标记的遗传和物理距离均已知，有利于基因的准确定位，因此，目前 SNP标记已广泛应用于线虫突变基因定位[22]。本研究以SNP为标记，对突变体的突变位点进行定位，ms1(N2背景)与CB4856杂交，得到经同源重组的纯合突变F2系。根据经典的两点定位法进行遗传作图，选择检测中间位置的SNP定位染色体，这样即便突变基因位于染色体远端(25)，纯合突变F2系中也有约56%的N2/N2 SNP(38% N2/CB, 6% CB/CB)[24]。在进行染色体内定位时，本文选择了约平均分布的8个SNP位点(表 2)，根据连锁交换定律，离突变位点越近，发生交换的概率越低。如表3所示，LGII:-6位置发生交换的概率最低，表明突变基因位于附近。本文得到 36个纯合突变 F2系，只能粗略地定位在染色体上较大范围的区间6～7 cM，如进一步的精细定位，则需要更多的F2系。

ms1对过量铜产生抗性(图 2B)，推测其产生的抗铜表型可能有两个原因：一是铜吸收减少或排出增加；二是ms1对过量铜的耐受性增加。同时已报道铜抗性相关基因遗传位置为：10个 ctr同源基因(LGI:-0.01、I:-14.71、I:-14.71、I:-14.71、II:0.11、IV:4.35、IV:4.35、IV:4.35、V:-2.97、X:23.94)、1个铜排出基因cua-1 (LGIII:21)、2个铜分子伴侣cuc-1 (LGIII:-0.54)和cutc-1 (LGIII:-0.27)、2个金属硫蛋白mtl-1 (LGV:0.13)和mtl-2 (LGV:6.07)、两个长寿基因daf-2 (LGIII:-8.03)和age-1 (LGII:3.61)、3个二价阳离子运输蛋白基因 smf-1 (LGX:-2.53)、smf-2 (LGX:-2.53)和smf-3 (LGIV:-6.93)[25]都不在本文所定位的区域。据此推测ms1的突变基因可能是参与铜代谢的新基因或是已有基因的新功能，从而为了解铜代谢及调控的分子机制提供了基础材料。

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(责任编委: 苗 龙)

Screening and SNP mapping of copper-resistant mutations in C. elegans

Shaojuan Song1, Yaping Guo2, Xueyao Zhang1, Jianzhen Zhang1, Enbo Ma1

1. Institute of Applied Biology, Shanxi University, Taiyuan 030006, China;
2. School of Life Science, Shanxi University, Taiyuan 030006, China

Copper plays critical roles in biological system; however, it is toxic in excess. To identify novel genes involved in copper metabolism, we performed a whole genome-wide genetic screen in C. elegans model organism to search for mutants which are resistant to excessive copper. Wild type (N2) L4worms were mutagenized with ethylmethane sulfonate (EMS), and the F2progeny were screened on culture medium with excess copper. Two copper-resistant mutants, ms1 and ms2, were recovered from the screening of 100 000 hyploid genomes. No obvious developmental defects were observed in ms1 and ms2 mutants, and they were able to grow into adults on screen medium plate, but N2 worms arrested in L1stage. Results of backcross test suggested that copper-resistant phenotype in ms1 may be controlled by a single recessive gene, but probably there are mutations in multiple genes in ms2, as no copper resistant worms could be found in F2progeny when ms2 mutants were backcrossed with N2 worms. To determine the mutation positions of ms1, we employed single nucleotide polymorphisms (SNPs) mapping. Our map-ping results indicated that ms1 mutation is on chromosome II (LGII). By analysis of 8 SNP markers from -18 to 23 on LGII, we found that ms1 mutation is at approximately LGII:-6. Further study on ms1 mutants will provide insights into copper metabolism and its regulation.

Caenorhabditis elegans; forward genetic screen; copper resistance; mutant; SNP mapping

2014-05-12;

2014-06-27

国家自然科学基金项目(编号：31071980)资助

宋少娟，博士研究生，研究方向：动物生化与分子生物学。E-mail: songshaojuan@126.com

马恩波，博士，教授，研究方向：动物生化与分子生物学。E-mail: maenbo2003@sxu.edu.cn

致 谢: 感谢中国科学院遗传与发育生物学研究所杨崇林研究员和刘锴博士在本文的设计、实验和成文过程中给予的指导和帮助。感谢卫青博士(Mayo Clinic, Rochester, MN，美国明尼苏达州，罗切斯特，梅奥医学中心)帮助修改英文摘要。

10.3724/SP.J.1005.2014.1261

时间: 2014-10-10 16:11:18

URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20141010.1611.002.html