腹部脂肪组织APN基因DNA甲基化及mRNA表达与维吾尔族T2DM的相关性

张君，张望强，丁毓磊，许彭，王婷婷，徐文静，陆环，刘宗智，谢建新



腹部脂肪组织基因DNA甲基化及mRNA表达与维吾尔族T2DM的相关性

张君1，张望强2，丁毓磊1，许彭1，王婷婷1，徐文静1，陆环1，刘宗智1，谢建新1

1. 石河子大学，新疆地方病与民族高发病教育部重点实验室，新疆石河子 832000；2. 石河子大学医学院第一附属医院心内科，新疆石河子 832000

为探讨基因启动子区DNA甲基化及mRNA表达与新疆维吾尔族T2DM发生、发展的相关性，文章选择新疆维吾尔族正常个体50例、肥胖个体48例、肥胖伴T2DM个体26例，收集腹部网膜脂肪组织，利用变性高效液相色谱技术检测基因启动子区DNA甲基化情况，应用Real-time PCR方法检测基因mRNA表达情况。结果显示，基因启动子区DNA甲基化阳性率在正常对照(34%)、肥胖(47.9%)及T2DM组(65.4%)逐渐增加，差异具有统计学意义(<0.05)。Real-time PCR结果显示，正常对照组mRNA相对拷贝数(0.7162)显著高于肥胖(0.4244)及T2DM组(0.4093)，差异具有统计学意义(<0.05)。非T2DM个体相关性分析提示，mRNA相对拷贝数与空腹血清葡萄糖(Fasting plasma glucose, FPG)、糖化血红蛋白(Glycosylated hemoglobin, HbA1c)、甘油三酯(Triglyceride, TG)水平显著负相关(<0.05)。基因启动子区DNA甲基化与其mRNA表达负相关，甲基化阳性组相对拷贝数(0.2700)显著低于阴性组(0.7870)，差异具有统计学意义(<0.01)。以上结果提示，基因启动子区DNA甲基化通过抑制其 mRNA表达导致糖脂代谢紊乱，可能参与了新疆维吾尔族肥胖及T2DM的发生、发展过程。

维吾尔族；2型糖尿病；腹部脂肪组织；脂联素基因；DNA甲基化

2型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus, T2DM)已成为危害人类健康的重要原因，其发病受遗传和环境因素相互作用的影响。2002年，Maier等[1]提出DNA甲基化在T2DM的发病过程中扮演着重要的角色。近期研究表明[2]，当T2DM患者肌组织暴露于炎性环境、游离脂肪酸或高血糖环境时，其基因将会发生过度甲基化。研究人员在T2DM前期患者中也发现了类似现象，提示DNA修饰的变化可能是糖尿病的早期事件之一。

脂联素(Adiponectin, APN)由成熟脂肪细胞特异分泌，是同时具有抗炎、增加胰岛素敏感性及心血管保护作用的脂肪细胞因子，是一个新的、重要的脂肪细胞因子家族成员[3]。目前有关基因DNA甲基化与肥胖及T2DM的相关性研究尚未见报道，DNA甲基化对基因mRNA表达的影响是否参与糖尿病的发生和发展还值得探讨。

新疆维吾尔族具有高脂肪、高蛋白、低碳水化合物饮食特点，而高热量饮食是T2DM患病的最主要危险因素之一，临床资料表明，维吾尔族T2DM发病率是汉族人群的2倍[4]。本研究通过分析腹部脂肪组织基因DNA甲基化状态和mRNA表达量来阐述该基因DNA甲基化在新疆维吾尔族T2DM发病过程中的作用。

1 对象与方法

1.1 对象分组

采集2012年10~12月及2013年4 ~5月喀什地区第一人民医院腹部择期手术患者124例，年龄20~80岁，所选患者于手术前1 d测定身高、体重、腰围、臀围及血糖指标，计算体质指数(Body mass index, BMI)和腰臀比(Waist to hip ratio, WHR)。根据BMI不同分为以下3组：对照组50例(18 kg/m2≤BMI≤24 kg/m2)，肥胖组48例(BMI>28 kg/m2)，2型糖尿病组26例(餐后2 h血糖≥11.1 mmol/L或空腹血糖≥7.0 mmol/L)。T2DM诊断符合1999年世界卫生组织的诊断标准，并排除1型糖尿病、肿瘤、急性炎症、肝肾疾病及近期服用可能干扰糖脂代谢药物的患者。

选取的非T2DM或T2DM患者，在择期手术时(如胆囊炎、阑尾炎等普外科手术，或者女性剖宫产等)收集腹部脂肪组织。由于所取材料的特殊性，样本选择过程中难免产生偏倚，选择样本时在组间尽量将年龄、性别等因素相匹配，使其对后续分析的影响降到最低。

1.2 方法

1.2.1 样本收集

各组于手术当日开腹后严格无菌操作取大网膜脂肪组织，约3 cm×3 cm置于5 mL冻存管内，标记住院号、姓名、性别，液氮冻存。避免电刀烧焦的脂肪，组织表面血液过多时使用0.9%生理盐水冲洗。

1.2.2 基因组DNA提取

严格按照说明书进行，所有样本的260/280比值在1.7~2.0之间，DNA样本置于-20℃保存备用。

1.2.3 DNA的亚硫酸氢盐修饰

取DNA样本1.8mg，严格按照DNA甲基化修饰试剂盒(EZ-DNA Methylation Mkit，购自美国Zymo Research公司)说明书步骤操作，对样本基因组DNA进行亚硫酸盐修饰，每组挑取2个标本测序验证。-20℃保存DNA溶液。

1.2.4 阳性对照DNA的获得

抽取健康志愿者外周血3 mL，用DNA提取试剂盒(上海生工公司)提取基因组DNA，取8 µL DNA，加2.5 µL CpG甲基化酶(M.Sss I)和S-腺苷甲硫氨酸，再加缓冲液于50 µL体系，37℃孵育4 h；采用EZ-DNA Methylation TM kit试剂盒(购自美国Zymo Research公司)进行甲基化修饰，-20℃保存DNA溶液。

1.2.5 生化指标测定

空腹血糖(Fasting plasma glucose, FPG)采用葡萄糖氧化酶法，总胆固醇(Total cholesterol, TC)、甘油三酯(Triglyceride, TG)、高密度脂蛋白(High density lipoprotein, HDL-C)、低密度脂蛋白(Low density lipoprotein, LDL-C)均采用全自动生化分析仪检测。糖化血红蛋白(Glycosylated hemoglobin, HbA1c)采用化学发光法进行检测。

1.2.6 DHPLC技术检测甲基化及结果判定

利用通用引物PCR扩增基因，扩增引物序列及目的片段长度见表1。

引物由上海生工生物技术服务有限公司合成。目的片段长度为525 bp，PCR扩增体系25 µL，其中10×PCR缓冲液(Mg2+plus) 2.5 µL，dNTP Mixture(各2.5 mmol/L) 2 µL，上下游引物(10 pmol/L)各1 µL，热启动酶(5 U/L) 0.5 µL(TaKaRa Taql~HOt Start Version，日本)，修饰后的DNA模板4 µL，灭菌双蒸水加至总体积25 µL。PCR扩增条件为：95℃预变性10 min；95℃变性30 s，58.0℃复性1 min，72℃延伸1 min，共35个循环；最后再72℃继续延续10 min。同时扩增甲基化酶(M.Sss 1)修饰的正常人外周血DNA为甲基化阳性对照，灭菌双蒸水取代处理后的DNA模板作为阴性对照。PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳验证。取PCR产物5 µL，变性温度56.4℃，运用变性高效液相色谱技术(Denaturing high performance liquid chromatography, DHPLC)对甲基化情况进行检测。

检测过程中设甲基化阳性(Methylation, M)及阴性(Unmethylation, U)标准品，以待测样品检测峰所处的位置判断其甲基化状态。若出现既有甲基化峰又有非甲基化峰的混合状态，只要出现甲基化峰，就判定其为甲基化阳性，若没有出现甲基化峰则判定为甲基化阴性。

1.2.7 Rela-time PCR检测mRNA相对拷贝数

取RNAlater固定的脂肪组织300 mg，采用TRIZOL一步法(RNA提取试剂盒TRIzol reagent, Invitrogen, 美国)提取网膜脂肪组织总RNA。取总RNA 3 μL逆转录合成cDNA(逆转录试剂盒ImProm- IITMPromega, 美国)。合成Rela-time PCR及内参GAPDH引物序列，见表1。

选择非特异性嵌合荧光染料SYBR GreenⅠ用7500型荧光定量PCR仪(美国ABI公司)对基因mRNA表达情况进行检测，2-ΔΔCT计算mRNA相对拷贝数。

1.3 统计学分析

采用SPSS 13.0进行统计学分析。正态分布的计量资料用`±表示，组间比较用检验；偏态分布的计量资料用(中位数)表示，相关性分析采用Pearson及Partial correlation法。

表1 各种引物序列表

1.4 实验室检测的质量控制

本研究在实施过程中制定严格的质量控制流程，包括患者的一般信息采集，腹部脂肪组织的收集等均设计有调查问卷，由一组人员完成。并且研究对象的选择尽量按照年龄、性别等因素匹配。RT-PCR及DNA甲基化检测均由2人同时完成。数据处理由统计学专业人员完成。

2 结果与分析

2.1 各组一般资料

经检验肥胖及糖尿病组体重、腰围、臀围、腰臀比及体质指数均显著高于正常对照组，差异有统计学意义(<0.05)。糖尿病组FPG及HbA1c显著高于正常对照和肥胖组，差异有统计学意义(<0.05)。肥胖组TG显著高于正常对照及糖尿病组，差异有统计学意义(<0.05)。肥胖组TC显著高于正常对照组，差异有统计学意义(<0.05)。正常对照组HDL显著高于肥胖及糖尿病组，差异有统计学意义(<0.05)，见表2。

2.2 DNA甲基化阳性率比较

PCR扩增基因启动子区，约525 bp(图1)，运用高效液相色谱色谱技术检测DNA甲基化情况(图2)。经统计学分析发现，在正常对照、肥胖及糖尿病组间甲基化阳性率分别是34%、47.9%、65.4%，差异具有统计学意义(2=6.903，<0.05)。以上结果提示，基因启动子区特定区段的DNA甲基化可能与新疆维吾尔族T2DM的发生发展相关。

2.3 APN mRNA相对拷贝数比较

通过比较各组脂肪细胞因子mRNA相对拷贝数，发现正常对照组显著高于肥胖及糖尿病组，差异具有统计学意义(<0.05)，结果见表3。

将98例非T2DM个体mRNA相对拷贝数与一般临床资料运用Pearson相关进行两变量间相关性分析，发现腹部脂肪组织mRNA相对拷贝数与BMI、DBP、FPG、HbA1c、TG、LDL水平显著负相关(<0.05)，结果见表4。采用偏相关(Partial corr­elation analysis)，扣除年龄、体重、BMI、腰围、臀围、腰臀比等因素后，mRNA相对拷贝数仍然与FPG、HbA1c、TG水平显著负相关(<0.05)，结果见表5。以上结果提示，基因mRNA表达紊乱，继而导致个体糖脂代谢的紊乱，可能参与了新疆维吾尔族T2DM的发生和发展过程。

表2 各组样本一般资料比较

注：BMI：体指数；SBP：收缩压；DBP：舒张压；FPG：空腹血糖；TG：甘油三酯；TC：胆固醇；LDL：低密度脂蛋白；HDL：高密度脂蛋白；HbA1c：糖化血红蛋白。*正常对照与肥胖及T2DM组相比差异均有统计学意义，<0.05；#肥胖组内男女性别间差异有统计学意义，<0.05。

图1 APN基因目的片段PCR扩增产物

F：肥胖；N：对照；T：糖尿病。

2.4 DNA甲基化与mRNA相对拷贝数相关性

根据DNA甲基化情况将样本分为甲基化阳性与阴性组，比较两组mRNA相对拷贝数，基因DNA甲基化阳性组(中位数：0.2700)显著低于阴性组(中位数：0.7870)，差异具有统计学意义(<0.01)，结果见图3。该结果提示，基因启动子区特定区段DNA甲基化与其mRNA表达水平呈正相关关系。

图2 DHPLC对APN基因甲基化检测

M：甲基化；U：非甲基化；F：肥胖；N：对照；T：糖尿病。

表3 各组样本APN mRNA相对拷贝数比较

注：*正常组与肥胖及糖尿病组比较差异均有统计学意义，<0.05。

表4 非T2DM个体APN mRNA相对拷贝数与临床资料相关性分析

注：*在非T2DM个体中mRNA相对拷贝数与BMI、DBP、FPG、HbA1c、TG、LDL显著负相关，<0.05。

表5 非T2DM个体APN mRNA相对拷贝数与临床资料偏相关性分析

注：*在非T2DM个体中扣除年龄、体重、BMI、腰围、臀围、腰臀比等因素后，APN mRNA相对拷贝数与FPG、HbA1c、TG水平显著负相关，<0.05。

图3 APN DNA甲基化与mRNA相对拷贝数相关性

3 讨 论

APN是成熟脂肪组织特异性分泌的蛋白质，其具有与瘦素相似的抗糖尿病特性，分子量为30 kDa[5]，主要在脂肪组织中表达，其浓度是其他脂肪因子的100倍。有研究表明，血浆APN水平在肥胖和T2DM的动物和人体内降低[6~8]，其与机体内脏脂肪含量密切相关[9]。研究发现，APN水平高的人群发生T2DM的危险性低，而APN水平低则预示胰岛素敏感性下降[10]。小鼠体内基因敲除后给予高脂饮食，其体内游离脂肪酸(Free fatty acids, FFA)清除受损，胰岛素抵抗加重，TNF-α水平升高[11~13]。以上结果提示在肥胖与T2DM发生过程中脂联素起着至关重要的作用。日本大阪大学的Hottak等[14]发现恒河猴患肥胖和T2DM后血浆中表达水平明显降低，同时证实APN与肥胖呈负相关。表达下降发生在肥胖早期并且在发生T2DM后继续下降。

本研究通过比较各组mRNA相对拷贝数后发现，正常对照组显著高于肥胖及T2DM组，差异均有统计学意义(<0.01)。同时肥胖组高于T2DM组，但差异无统计学意义(=0.753)；将样本腹部脂肪组织mRNA相对拷贝数与一般临床资料进行相关性分析后发现，腹部脂肪组织APN与FPG、HbA1c、TG显著负相关(<0.05)。以上研究结果提示，维吾尔族腹部脂肪组织APN水平与T2DM的发生发展负相关，可能是由于肥胖过程中腹部脂肪组织增多引起APN表达降低，继而导致胰岛素抵抗，直至T2DM的发生。

一般来说，DNA甲基化与基因表达呈负相关，不仅启动子区高甲基化与基因表达负相关，基因内部的甲基化与基因表达也存在着弱的负相关，而启动子区低甲基化与转录活性正相关。已有研究表明，DNA甲基化参与了炎性反应状态、氧化应激、胰岛素抵抗等过程[15,16]。DNA甲基化在T2DM的发生中发挥一定作用，如甲基化导致的锌指蛋白基因沉默及母体的低甲基化综合征与新生儿短暂性糖尿病密切相关[17]；胰岛素启动子DNA甲基化参与胰岛素的表达调控，且与HbAlc水平相关[18]。近年来使用基因组学技术研究T2DM患者基因的表达和变异，产生了许多新的T2DM的候选基因，这些相关基因的甲基化状态的改变继而导致其表达水平的变化与T2DM发生发展密切相关[19]。

本研究运用高效液相色谱色谱技术检测基因启动子区甲基化情况。统计学分析后发现，基因启动子区DNA甲基化在正常对照、肥胖及T2DM组间甲基化阳性率逐渐增加，差异有统计学意义(34%、47.9%、65.4%，<0.05)。根据DNA甲基化情况将样本分为甲基化阳性与阴性组，比较两组mRNA相对拷贝数后发现，甲基化阳性组显著低于阴性组，差异有统计学意义(中位数：0.2700 vs 0.7870，＜0.01)。提示基因启动子区DNA甲基化导致其mRNA表达抑制，而课题组前期研究结果亦表明维吾尔族T2DM患者血清APN水平显著低于正常对照个体[20]。

本研究结果提示，在维吾尔族T2DM发生发展过程中，腹部脂肪组织关键细胞因子基因启动子区DNA甲基化状态发生了改变，导致其表达紊乱，从而引发T2DM的发生。而引起甲基化状态发生改变的具体机制目前还不清楚，有待进一步的研究加以阐明，可能与维吾尔族生活环境及特有的生活方式有关。

[1] Maier S, Olek A. Diabetes: a candidate disease for efficient DNA methylation profiling., 2002, 132(8): 2440S–2443S.

[2] Barrès R, Osler ME, Yan J, Rune A, Fritz T, Caidahl K, Krook A, Zierath JR. Non-CpG methylation of the PGC-lα promoter through DNMT3B controls mitochondrial density., 2009, 10(3): 189–198.

[3] 霍丽梅, 宋光耀, 叶蔚. 脂联素与2型糖尿病发生发展的研究进展. 临床汇萃, 2005, 20(1): 54–56.

[4] 徐忠星, 张和占, 买买提·西日甫, 买买提阿不拉艾山, 库热西江·托乎提, 程钦, 董宇莉, 依米提, 艾山江. 新疆墨玉县维吾尔族糖尿病患病率调查. 中国基层医药, 2002, 9(3): 221.

[5] Scherer PE, Williams S, Fogliano M, Baldini G, Lodish HF. A novel serum protein similar to C1q, produced exclusively in adipocytes., 1995, 270(45): 26746–26749.

[6] Yamauchi T, Kamon J, Waki H, Terauchi Y, Kubota N, Hara K, Mori Y, Ide T, Murakami K, Tsuboyama-Kasaoka N, Ezaki O, Akanuma Y, Gavrilova O, Vinson C, Reitman ML, Kagechika H, Shudo K, Yoda M, Nakano Y, Tobe K, Nagai R, Kimura S, Tomita M, Froguel P, Kadowaki T.The fat-derived hormonead-iponectin reverses insulin resistance associated with both lipoatrophy and obesity., 2001, 7(8): 941–946.

[7] Hotta K, Funahashi T, Arita Y, Takahashi M, Matsuda M, Okamoto Y, Iwahashi H, Kuriyama H, Ouchi N, Maeda K, Nishida M, Kihara S, Sakai N, Nakajima T, Hasegawa K, Muraguchi M, Ohmoto Y, Nakamura T, Yamashita S, Hanafusa T, Matsuzawa Y. Plasma concentrations of a novel, adipose-specific protein, adiponectin, in type 2 diabetic patients., 2000, 20(6): 1595–1599.

[8] Abbasi F, Chu JW, Lamendola C, McLaughlin T, Hayden J, Reaven GM, Reaven PD. Discrimination between obesity and insulin resistance in the relationship with adiponectin., 2004, 53(3): 585–590.

[9] Côté M, Mauriège P, Bergeron J, Alméras N, Tremblay A, Lemieux I, Després JP. Adiponectinemia in visceral obesity: impact on glucose tolerance and plasma lipo protein and lipid levels in men., 2005, 90(3): 1434–1439.

[10] Lindsay RS, Funahashi T, Hanson RL, Matsuzawa Y, Tanaka S, Tataranni PA, Knowler WC, Krakoff J. Adiponectin and development of type 2 diabetes in the pima Indian population., 2002, 360(9326): 57–58.

[11] Bobbert T, Rochlitz H, Wegewitz U, Akpulat S, Mai K, Weickert MO, Möhlig M, Pfeiffer AF, Spranger J. Changes of adiponectin oligomer composition by moderate weight reduction., 2005, 54(9): 2712–2719.

[12] Maeda N, Shimomura I, Kishida K, Nishizawa H, Matsuda M, Nagaretani H, Furuyama N, Kondo H, Takahashi M, Arita Y, Komuro R, Ouchi N, Kihara S, Tochino Y, Okutomi K, Horie M, Takeda S, Aoyama T, Funahashi T, Matsuzawa Y. Diet-induced insulin resistance in mice lacking adiponectin/ACRP30., 2002, 8(7): 731–737.

[13] Kubota N, Terauchi Y, Yamauchi T, Kubota T, Moroi M, Matsui J, Eto K, Yamashita T, Kamon J, Satoh H, Yano W, Froguel P, Nagai R, Kimura S, Kadowaki T, Noda T. Disruption of adiponectin causes insulin resistance and neointimal formation., 2002, 277(29): 25863– 25866.

[14] Hotta K, Funahashi T, Bodkin NL, Ortmeyer HK, Arita Y, Hansen BC, Matsuzawa Y. Circulating concentrations of the adipocyte protein adiponectin are decreased in parallel with reduced insulin sensitivity during the progression to type 2 diabetes in rhesus monkey., 2001, 50(5): 1126–1133.

[15] Dwivedi RS, Herman JG, McCaffrey TA, Raj DS. Beyond genetics: epigenetic code in chronic kidney disease., 2011, 79(1): 23–32.

[16] Bechtel W, McGoohan S, Zeisberg EM, Müller GA, Kalbacher H, Salant DJ, Müller CA, Kalluri R, Zeisberg M. Methylation determines fibroblast activation and fibrogenesis in the kidney., 2010, 16(5): 544–550.

[17] Laborie LB, Mackay DJG, Temple IK, Molven A, Søvik O, Njølstad PR. DNA hypomethylation, transient neonatal diabetes, and prune belly sequence in one of two identical twins., 2010, 169(2): 207–213.

[18] Yang BT, Dayeh TA, Kirkpatrick CL, Taneera J, Kumar R, Groop L, Wollheim CB, Nitert MD, Ling C. Insulin promoter DNA methylation correlates negatively with insulin gene expression and positively with HbA levels in human pancreatic islets., 2011, 54(2): 360–367.

[19] Martínez JA, Milagro FI, Claycombe KJ, Schalinske KL. Epigenetics in adipose tissue, obesity, weight loss, and diabetes., 2014, 5: 71–81.

[20] 张君, 王燕, 袁红玲, 葛家璞, 邓峰美, 韩刚, 宫存杞, 谢建新. 新疆维吾尔族2型糖尿病患者血清脂联素水平及影响因素. 中国糖尿病杂志, 2008, 16(9): 533–534.

(责任编委: 陈雁)

Correlation between type 2 diabetes and DNA methylation and mRNA expression ofin abdominal adipose tissues in Xinjiang Uygur population

Jun Zhang1, Wangqiang Zhang2, Yulei DING1, Peng Xu1, Tingting WANG1, Wenjing Xu1, Huan Lu1, Zongzhi Liu1, Jianxin Xie1

To investigate the relationship between type 2 diabetes mellitus (T2DM) onset and development and mRNA expression and promoter methylation of adiponectin () gene in abdominal adipose tissues of Xinjiang Uygur population, abdominal adipose tissues of omentum were collected and divided into control, obesity and T2DM groups. The status ofpromoter methylation was detected by denaturing high performance liquid chromatography (DHPLC), while the mRNA expression level ofwas detected by RT-PCR. Results show that methylation positive rate ofwas at the lowest level in control, middel in obesity and highest in T2DM groups, and the differences are statistically significant. Comparing themRNA relative copy number of adipose tissue in each group, we found that the relative copy number ofin control group is significantly higher than that of obesity and T2DM groups. There is a negative correlation between the mRNA expression level ofin abdominal adipose tissue and fasting plasma glucose (FPG), glycosylated hemoglobin (HbA1c) and triglyceride (TG) level. There is a negative correlation in DNA promoter methylation and mRNA expression ofgene. Relative copy number ofin DNA methylation positive group is significantly lower than that of the negative group. In conclusion, increasedpromoter methylation results in decreased mRNA expression, which induces glucose and lipid metabolic disorder, thus contributing to the initiation and development of T2DM in Xinjiang Uygur population.

Uygur people; T2DM; abdominal adipose tissue;gene; DNA methylation

2014-06-19;

2014-10-11

石河子大学重大科技攻关计划项目(编号：gxjs2012-zdgg02)和石河子大学高层次人才科研启动资金专项(编号：RCZX201230)资助

张君，博士，副教授，研究方向：肥胖及代谢相关疾病病因学研究。E-mail: zhangjunyc@163.com张望强，硕士，主治医师，研究方向：临床心血管病。E-mail: 616692381@qq.com张君和张望强并列第一作者。

谢建新，博士，教授，研究方向：分子生物学。E-mail: xiejianxin9017@sina.com

10.16288/j.yczz.14-199

2015-1-5 10:54:33

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20150105.1054.003.html