日本七鳃鳗物种特异性microRNAs及其前体的识别与验证

刘欣，张洁，赵春晖，李铁松，王继红，李庆伟



日本七鳃鳗物种特异性microRNAs及其前体的识别与验证

刘欣1,2，张洁1,2，赵春晖1,2，李铁松1,2，王继红1,2，李庆伟1,2

1. 辽宁师范大学生命科学学院，大连 116081；2. 辽宁师范大学七鳃鳗研究中心，大连 116081

MicroRNAs(miRNAs)对参与多种生物代谢过程的基因在转录及转录后水平进行负调控。近年来，随着深度测序及芯片技术的应用，有关miRNA的发现和功能分析在植物和动物中得到广泛研究。文章利用第二代测序技术对日本七鳃鳗()白细胞的小RNA进行了高通量测序，共得到5 207 787条小RNA序列，其中4 739 346条序列可以拼接为10 989种miRNA变体。基于序列相似性分析，发现这10 989个变体序列与306个已知的保守miRNA家族成员序列相匹配；其中，6个保守miRNA家族成员呈极高丰度表达，表明miRNA在物种间具有保守性。70个未注释序列被预测为新的miRNA。通过miRNA微阵列技术鉴定与验证了34个新预测的miRNA在免疫处理的日本七鳃鳗白细胞中表达，其中16个miRNA前体的最低折叠自由能系数大于0.85，说明日本七鳃鳗存在特异性miRNA。这些物种特异性miRNAs的存在可能在日本七鳃鳗的白细胞生长、发育和对疾病的反应中发挥重要的调控作用。

日本七鳃鳗；物种特异性miRNA；高通量测序；基因芯片

20世纪90年代，Lee等[1]首次在线虫()中发现一种内源的、长约22nt的非编码小RNA，命名为lin-4；lin-4通过RNA-RNA的相互作用方式参与对线虫胚胎后期发育基因lin-14的调控。2000年，Reinhart等[2]在中又发现了第二个长约21nt的非编码小RNA——let-7，作为时序调控基因lin-14、lin-28、lin-41、lin-42和daf12的开关基因，let-7失活或过表达可导致线虫幼虫的滞育或早熟。

2001年，Lagos-Quintana等[3]从果蝇()和人体中克隆了49个类似线虫lin-4的小RNA基因，并把它们正式定名为microRNA (miRNA)；研究发现，无脊椎动物和脊椎动物存在的这些新的miRNA在序列上高度保守。至2001年底，多个研究小组通过直接对小RNA克隆和测序从各种动物中鉴别出数百个miRNA基因[4,5]。之后，随着多种模式生物基因组测序工作的相继完成使得全基因组搜索miRNA成为可能[6]。结合分子克隆和计算机识别方法，在动物[7~9]、植物[10~14]甚至病毒中[15,16]确定了成千上万的miRNA基因，仅在人类就验证了2558个miRNAs (http://www.mirbase.org/cgi-bin/bro­wse.pl?org=hsa)[17]。对部分miRNAs的功能研究分析提示：miRNAs参与生命过程中一系列的重要进程，包括发育进程[2]、细胞增殖与凋亡[18]、脂肪代谢[19]、造血过程[20]、生殖干细胞自我更新[21]及肿瘤发生[22]等。

随着第二代高通量测序技术的发展，已在越来越多的物种中发现了新的miRNA基因[23~26]。七鳃鳗属于圆口纲、七鳃鳗目，是迄今为止最原始的无颌类脊椎动物，是现存脊椎动物亚门中最古老的物种[27]。长久以来，七鳃鳗在进化上因联系着脊椎动物与无脊椎动物而具有极高的研究价值。目前，国内外对七鳃鳗miRNA的研究很少，仅见Heimberga等[28]于2010年采用小RNA测序和基因组检索方法对海七鳃鳗()、普氏七鳃鳗()和盲鳗()的miRNA进行了识别和鉴定，并以七鳃鳗和盲鳗的miRNAs作为保守的遗传标记对它们之间的系统演化地位进行了讨论。由于miRNA具有种间保守性、组织表达特异性和时序性，本文运用高通量测序以及基因芯片技术在日本七鳃鳗()免疫激发后的白细胞中发现和鉴定免疫组织中表达保守的miRNA以及物种特异性miRNA，以期对未来探索miRNA在其免疫应答过程中的调控作用奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料

日本七鳃鳗捕获自黑龙江省松花江流域同江地区，活体置于实验室水族箱驯养(2~5℃)。1周后选取32条无外伤、健康的个体(体长35~55 cm) ，以腹腔注射100 μL复合抗原进行免疫刺激。复合抗原用50 mmol/L磷酸缓冲液(pH7.0) 配制，含大肠杆菌(DH5ɑ) (TaKaRa, Dalian)、灭活的金黄色葡萄球菌() (TaKaRa, Dalian) 和啤酒酵母菌() (市售)各1×107个/mL。经过3次加强免疫(每周1次) ，末次免疫后3 d断尾取血，采用ficoll密度梯度离心法进行单核白细胞分离[29]。

1.2 日本七鳃鳗小RNA测序及分析

使用RNAiso Reagent (TaKaRa, Dalian)提取日本七鳃鳗白细胞总RNA，在获得符合测序标准的总RNA样本后，委托深圳华大基因股份有限公司构建测序文库并用Illumina GA IIx进行测序及分析。经Solexa测序，获得35nt序列，通过去接头、去低质量、去污染、统计序列长度分布等过程完成初级分析。将初级分析得到的序列按照文献[30]中的生物信息分析流程及分析软件(包括BLAST和华大基因自主开发的分析软件Tag2annotation)进行分类注释，获得样品中包含的各种RNA及表达量信息。将其中miRNA片段与miRBase17.0中所有动、植物的miRNA成熟序列进行比对进行注释，统计在样品中出现的miRNA家族(不分物种)、序列及其数量。余下的未注释片段以近缘种海七鳃鳗(.)基因组(http://asia.ensembl.org/Petromyzon_marinus/Info/ Index)为参考基因组进行新miRNA及其前体的预测。预测软件采用华大基因自主开发的分析软件MIREAP (http://sourceforge.net/projects/mireap/)[30]。利用mFOLD软件(http://mfold.rit.albany.edu/?q= mfold/ Structure-display-and-free-energy-determination)计算获得茎环结构的最小折叠自由能(MFE，ΔG值(kcal/ mol))。以最小自由能量指数(MFEI，MFEI =(MFE/前体序列长度)×100/(G%+C%))大于0.85为鉴定miRNA前体的标准[31]。

1.3 miRNA基因芯片实验与分析

miRNA的定制基因芯片检验工作委托美国LC Sciences公司进行实验与分析。在μParaflo[32]微流体芯片上，每条检测探针使用PGR(photogenerated reagent)化学法进行原位合成。被检测目标选自miRBase中几种低等脊椎动物的miRNA(如海七鳃鳗301条；佛罗里达文昌鱼()189条；斑马鱼()248条；铅点东方鲀()109条；玻璃海鞘()511条；非洲爪蟾()168条；囊舌虫()114条)以及在日本七鳃鳗中预测的新miRNA 70条。杂交后检测使用标记特异性的Cy5荧光染料。利用激光扫描仪(GenePix 4000B，Molecular Device)采集杂交图像并使用Array-Pro图像分析软件(Media Cybernetics)进行图像数字化转换。数据分析首先是减除背景值，然后使用LOWESS过滤(Locally-Weighted Regression)进行信号归一化[33]。被列为可检测的转录子必须至少符合两个条件：信号强度>3×(背景标准偏差)并且点变异系数(spot)<0.5。值通过计算(标准偏差)/(信号强度)获得。只有当超过50%的重复探针的信号值大于检测水平，才认为该转录子可以被检测[33]。

2 结果与分析

2.1 小RNA测序结果

通过高通量测序，最终获得日本七鳃鳗各种小RNA分子数量见表1。共获得5 207 787个小RNA读数(Read)，其中miRNA有4 739 346个读数，占91%，拼接后可归为10 989种一致序列片段。有7.54%的小RNA片段属于未注释的未知序列，还有少量的转运RNA(tRNA，0.74%)、核糖体RNA(rRNA，0.66%)、小核RNA(snRNA，0.05%)和核仁小RNA (snoRNA，0.01%)等，说明测序结果较好。日本七鳃鳗miRNA成熟序列的长度和其他物种一样，大部分(占总数的87.66%)集中在20~24nt之间(图1)。

2.2 保守miRNA家族表达谱

通过与数据库比对，上述10 989条miRNA一致序列被注释为306个保守miRNA家族的不同变体。其中201个保守miRNA家族的各个变体表达丰度之和小于10个读数，说明大多数(65.7%)保守miRNA为低丰度表达；75个保守miRNA家族的各个变体表达丰度之和介于10~1 000之间，属于中丰度表达；30个miRNA家族的表达丰度高于1 000个读数(表2)，从编号可以看出它们绝大多数为最先被发现的miRNA家族(15个编号小于100，9个编号小于200)。这30个家族共包括9 560个miRNA变体，由4 729 961个读数组成，分别占保守miRNA家族(共10 989条miRNA)一致序列的87.0%和总读数(4 739 346)的99.8%。其中，let-7、miR-146、miR-184、miR-143、miR-30、miR-142等6个家族的miRNA表达丰度均超过10万个读数，占总读数的94.1%。这些结果表明，极少数保守miRNA家族的成员呈极高丰度表达，反映出miRNA在物种间具有保守性。

表1 高通量测序获得七鳃鳗小片段RNA种类及数量

图1 七鳃鳗miRNA成熟序列核苷酸分布情况

表2 日本七鳃鳗高丰度表达的miRNA家族

2.3 七鳃鳗新miRNA的预测及验证

利用高通量测序未注释的小RNA片段，用华大基因自主构建的miRNA及其前体预测软件MIREAP共预测得到70个新的miRNA成熟序列。通过定制芯片微阵列分析验证(表3)，有35个预测的新miRNA成熟序列的检测信号符合信号强度大于基值的3倍且点变异系数(spot CV)小于0.5这两个检测条件，说明它们是真实存在的。

从表3中可见，有8种预测的物种特异性miRNA (Ljm-058、Ljm-037、Ljm-016、Ljm-073、Ljm-004、Ljm-049、Ljm-023和Ljm-065)的信号强度高于1 000，占23.5%；尤其是Ljm-058、Ljm-037和Ljm-073不仅芯片检测信号强度高，而且在测序检测中读数值也高。信号强度介于100~1 000之间的有16个物种特异性miRNA，占47.1%。信号强度小于100的有10个，占29.4%。由此可见，大多数预测的物种特异性miRNA在受抗原免疫激发后的日本七鳃鳗免疫细胞中均有较高水平的表达。

对新预测的物种特异性miRNAs，其鉴定还需要预测是否存在能折叠成较稳定的发卡结构的前体序列的支持。根据海七鳃鳗基因组数据，预测的物种特异性的miRNA的成熟和前体序列以及前体序列的二级结构(GenBank序列登录号：KJ031059~ KJ031093)见表4。这些miRNA前体的最小折叠自由能介于-19.7 kcal/mol~-49.56 kcal/mol之间，最小折叠自由能系数介于0.48~1.64之间。有16个miRNA前体的最小折叠自由能系数大于0.85。

表3 日本七鳃鳗新miRNA候选序列的定制miRNA芯片分析验证

注：加粗的探针表示该探针所检测的信号强度满足文中设定的两个检测条件。

表4 日本七鳃鳗新miRNA序列及其二级结构

续表

新预测miRNAmiRNA成熟及前体序列二级结构预测Mfe(kcal/mol)MfeI Ljm-028-3pGATGGTGATAGGTGCAGTGCTGCAAGTTACTCTTTTGATGAAATTACATAGTGATTTGTGATTGCGGGCTACTGAGGCAGATTCCAT.((((.(((..((.(((((((((((.((((...((..(((......)))...))...)))))))).))).))))..))..)))))))-30.20.81 Ljm-030-3pTCCAGTGCTGGAAGCTTCTGCAGGGAACGGACTTCACTCAGCTGAGTTGACGCGACTGAATTGATTCAACTCCTTGAAGAAGCTCCCAGCAGGTGG.(((.((((((.(((((((.((((((...((..(((.((((.((.(....).)).))))..))).))...)))))).))))))).))))))..)))-38.20.75 Ljm-031-3pAATCTTCATTTGAAGCTTTCGTGACTGCAGGAATCCATACTCTTTGGCTCTTTCGGTAAAGTCACGTAGGCTCATCCCCTGAT.(((......(((.((((.(((((((((.((((.(((.......)))...)))).))..))))))).)))))))......)))-21.70.59 Ljm-033-5pCTTTGGTTATTTCGGTAAAGTCACGTAGGTGCAAATTTCGGATTCCAGTACCTACGTGACTTTACCGAAAGAACCAAAGA((((((((.(((((((((((((((((((((((...............))))))))))))))))))))))).)))))))).-49.561.5 Ljm-034-3pCTTTGGTTCTTTCGGTAAAGTCGCGTAGGTACAACATGAAATAAATCACGTTATTTCGAACCTACGTGACTTTACCGAATGAACCAAAGA(((((((((.((((((((((((((((((((......((((((((......)))))))).)))))))))))))))))))).))))))))).-50.91.64 Ljm-037-5pCGCGCGGGGGAAAAGTGCAAATAGTGGTAGGTAGTGATCACTGCCGTCTGCCTACTCCATTTGCATTTTGGCCTCCGTGCGT((((((((((.(((((((((((.(..((((((((((........)).))))))))..))))))))))))..)))))))))).-46.41.03 Ljm-039-5pTTATACAGGTAACGAGCTGAGATTAGGAGAACGCTCTTAAAGGGAGTGCTCCTAAACTCAGCTTGTTACCTGTATAAA(((((((((((((((((((((.(((((((..((((((.....))))))))))))).))))))))))))))))))))).-51.81.62 Ljm-040-5pACACGTATATACCGGATTATAAGACGCACCCGCACATCATTTCCTTTAAAACGCAGGGGAAACGTGCGCCTGATGATCCGGTGAACATGGTC...(((.(.(((((((((((.((.(((((..........((((((((.......)))))))).))))).)).))))))))))).).)))...-29.20.65 Ljm-041-5pGTTGCCCATTACGGATCTGGCTTCTGAGGCTAGCAACCACTGCGTTGAGGCTAGCAACCGCTGCGTTGCT((.((.((...(((..((((((((.((.((.((......)))).))))))))))...))).)).)).)).-19.20.48 Ljm-044-5pTGTCCCGCTGAGGTCAGGATGGGCAGCAATGCGTGACTAGATCCTGTATTGCACTCGTCCCGGCCTTAGCGAGATT.(((.((((((((((.(((((((..((((((((.((.....)).)))))))).))))))).)))))))))).))).-40.70.95 Ljm-047-3pTTTTTTTCTATCTACATGACTTTACCGAAAGAAACAAAAAATATGAATTCCATACTCTTTGGTTCTTTCGGTAAAGTCATGTAGGTACAGTGAGGGAA.((((((((((((((((((((((((((((((((.((((.(.((((.....)))).).)))).)))))))))))))))))))))))))....)))))))-441.38 Ljm-049-5pTCAATGTAAACACCCTACACTCTCAGCTGTGCGCCATTGGTTAGCTGGGAGTGGGGTGTTTATGTTGACTGCCTTA(((((((((((((((..((((((((((((...(((...))))))))))))))))))))))))))))))........-40.31.09 Ljm-053-5pCACCGTAGCAGCACGTAAATATTGGAGTGTGAACTCTGCGATTCCAGTATTTCGTGCTGCTGCTGTGCGGTGGG.....((((((((((.((((((((((((((.......)).))))))))))))))))))))))............-38.80.98 Ljm-057-5pCCCACATGGTGTTGGACCAGATGACGCCACATGGTCTCACATGGTGCTGGACCAGATGACGTCACATGGTTCCACATGGTGTTGGA((.((((.((((.((((((..(((((.((..(((((((((...)))..))))))..)).)))))..)))))).)))).)))).)).-400.85 Ljm-058-5pCGTGCATTGTTAAAGTGCAGATAGTGGTAGTTGGTCCTAAAAATGACAGCTACTCTATTTACACTTTAAACACTGTGCGG((..((.((((((((((.((((((.((((((((.((........)))))))))))))))).)))))).)))).))..)).-31.80.99 Ljm-061-3pAGACAATACCTCAGAATTGTCAGGGTGCTCAGCAATCCGCACCTGACAGTGCTGGGGTTTAGTCTCAGCAGAC((((...(((((((.(((((((((.(((..........)))))))))))).)))))))...))))........-31.50.83 Ljm-063-5pTGCGCATCAGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACATCCATCTTGTAGCGAACGACCTACAGCGAACTGAGATACCTACGGCGTG.((((.(((((...((((...(((..((((((..(((.........))).))))))..))).))))..)))))..........)))).-27.30.54 Ljm-065-5pGGCTGTGCGATGAGGTAGTAGTTGTATAGTTTTTTGGGTGCAATCCCAAACGGGTAACTGTACAATCTACTGTCTTTCCCACGGCTT(((((((.((.(((..(((((((((((((((.((((((......)))))).....)))))))))).)))))..))))).))))))).-39.30.98 Ljm-066-3pGCGCGATGCCTGCCGTTTCGATCCCCGTGCCGGGAAGCTTCTTCGGGAACTGCACGTGGAGCGAAATGTTTGGCGTCACGTCG(((.((((((...(((((((.(((.(((((.(.((((...)))).....).))))).))).)))))))...)))))).)))..-35.50.68 Ljm-072-5pTTAGATCTTGTGGTGGACCTGGATGAGACAGAGTACTGAGATCGGGTCTCTCTTAAGCCCTCCACACGGTTTAT.((((((.(((((.((.(..(((.(((((.((.........))..))))))))...).)).))))).)))))).-27.10.75 Ljm-073-5pGCGAGGGTGATGTAAACATCTCAACTGGAAGCTGTGACGTCAGTAAAGGCTTTCAGTTAGGTGTTCACGTCAGCACGCTAC(((..(.((((((.(((((((.(((((((((((...((....))...)))))))))))))))))).)))))).).)))...-38.60.97

注：miRNA前体序列中加粗的部分为成熟序列；miRNA前体序列的二级结构中，“.”表示颈环区碱基，“(”和“)”表示互补的碱基；Mfe为最小折叠自由能，MfeI为最小折叠自由能系数。

3 讨 论

miRNAs是重要的基因表达调节因子，它们通过在转录后水平抑制特异的靶基因表达来行使功能。最近的研究表明，miRNA在哺乳动物先天免疫和适应性免疫两大系统中具有独特的表达谱，在免疫细胞的发育和功能的调节中起关键作用[34]。近年来，一种平行于脊椎动物适应性免疫系统的以可变淋巴受体为特征的适应性免疫系统在七鳃鳗中被发现[35]，拓宽了关于适应性免疫系统起源与进化的研究视野。目前，对无颌类免疫系统免疫应答机制方面的研究还不多见，尤其是关于七鳃鳗miRNA在免疫应答过程中的调控角色及其功能研究，在国内外尚未见报道。因此，开展七鳃鳗免疫组织中miRNA的基础研究将对未来探索miRNA在其免疫应答过程中的调控作用奠定基础。

高通量测序技术的兴起，大大降低了基因组学研究的时间和成本，同样为编码及非编码RNA的转录组学研究的快速发展提供了可能。本文通过对日本七鳃鳗单个核白细胞的miRNA进行测序，发现少数保守的miRNA家族(let-7、miR-146、miR-184、miR-143、miR-30、miR-142)在七鳃鳗免疫组织中呈现极高丰度表达。let-7最早在线虫中被发现，能够调控细胞的分化和增殖的时序[2]；人miR-146可以调控干细胞的增殖和迁移[36]；miR-184可调控神经细胞的发育与凋亡[37]；miR-143与鼠胚胎干细胞向心脏祖细胞的分化调控有关[38]；miR-30调节爪蟾前肾的发育过程[39]；miR-142能够调节造血干细胞的分化[40]。这些保守miRNA家族都具有调控细胞增殖和分化的功能，推测在七鳃鳗免疫系统免疫应答过程中，它们对免疫细胞的活化、分化、增殖的调控过程也应该起重要作用。

本文测序结果显示，除了物种间保守的miRNA家族外，尚发现七鳃鳗物种特异性miRNA的存在。对物种特异性miRNA的鉴定需要有实验数据的支持，因此本文采用高通量的定制芯片对候选的70个miRNA进行了检测。从芯片验证结果看，有34个候选的miRNA在免疫处理后的日本七鳃鳗单个核白细胞中的表达情况被有效检出，但有些miRNA的芯片检测信号强度与测序实验检测到的读数丰度不匹配(表3)。Ljm-004、Ljm-016、Ljm-023、Ljm-049及Ljm-065芯片检测信号较强，但测序读数丰度较低。另外，有些在测序检验时较高丰度表达的miRNA(Ljm-026、Ljm-041和Ljm-044)在芯片检测时信号较低。究其原因可能和分别送到测序和芯片测试公司的总RNA样本在提取时间、提取的个体方面存在的差异所致。有研究认为，在高通量测序结果中，必须有 10 个拷贝以上的表达量(不含变体的表达量)来支持该小RNA的表达标准[41]。但本研究发现，测序读数低于10的8种预测的物种特异的miRNA在利用定制芯片检测时都能被有效检测出来，并且Ljm-016、Ljm-018、Ljm-023和Ljm-072的检测信号强度均在500以上，说明miRNA表达具有时效性。尽管目前利用qPCR作为miRNA检测的工具具有准确、灵敏等优点，但定制芯片检测技术在通量和实验成本上无疑为物种特异性miRNA的验证提供了高效和快速的通道。

对所预测的miRNA的鉴定还要以其是否存在能折叠成较稳定的发卡结构的前体序列来确定。前体序列的预测一般需要该物种基因组数据的支持。由于目前还未进行日本七鳃鳗基因组的测序，本文曾尝试利用第二代测序技术获得的该物种白细胞转录组数据进行前体预测，许多新预测的miRNA也不能得到完全定位，分析原因可能是测序深度和覆盖度不够[42]。由于海七鳃鳗为日本七鳃鳗近缘物种，序列一致性一般在93%以上，有些保守基因甚至能达到100%一致性[45]，因此本研究采用海七鳃鳗的基因组数据作为参考基因组进行特异性miRNAs的前体鉴定。从预测结果看，在所预测的物种特异性miRNA的前体序列中，有16个最小折叠自由能系数达到0.85以上，说明这16个物种特异性miRNA符合新miRNA鉴定标准[46]。另外的18个候选miRNA的成熟miRNA可被芯片检测验证，但所预测的前体序列的最小折叠自由能系数均小于0.85这个阈值，可能是由于海七鳃鳗基因组数据的组装程度较低(覆盖率80%左右)而形成许多缺口，导致不能准确定位所致[43]。

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(责任编委: 胡松年)

The identification and verification of species-specific microRNAs and their precursors in

Xin Liu1,2, Jie Zhang1,2, Chunhui Zhao1,2, Tiesong Li1,2, Jihong Wang1,2, Qingwei Li1,2

MicroRNAs (miRNAs) negatively regulate genes which are involved in various biological processes of metabolism at both transcriptional and post-transcriptional levels. In recent years, the existence and function of miRNAs have been extensively studied in plants and animals with the application of deep sequencing and microarray technology. In this study, small RNAs from leucocytes of() were sequenced using the second generation high-throughput sequencing technology. A total of 5 207 787 small RNA sequences were identified, and 4 739 346 of them assembled into 10 989 variants. Based on sequence similarity analysis, the sequences of thesevariants matched known miRNAs of 306 conserved families, among which 6 conserved miRNA family members expressed at an extremely high level which reflected the conservatism of miRNAs among species. In addition, 70 unannotated sequences were predicted to be new miRNAs, and 34 of them were further verified expressing in antigen-treatedleucocytes by miRNA microarray assay. Moreover, the minimal folding free energy indexes for 16 of the 34 miRNA precursors exceed 0.85, indicating the existence of species-specific miRNAs inwhich may play important roles in regulating, growth, development and disease response ofleukocytes.

; species-specific miRNA; high-throughput sequencing; microarray assay

2014-11-25;

2015-01-19

国家重大基础研究发展规划项目(973计划) (编号：2013CB835304)和国家自然科学基金项目(编号：31271323)资助

刘欣，教授，硕士生导师，研究方向：细胞生物学。E-mail: liuxin@lnnu.edu.cn

李庆伟，教授，博士生导师，研究方向：细胞生物学。E-mail: liqw@263.net

10.16288/j.yczz.14-411

2015-1-21 10:52:51

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20150121.1052.001.html