散瘀止痛凝胶膏剂质量标准研究

张玉娥,王贤儿,关琴笑,石楚婷,谷 捷,谭娥玉

(1.江门市五邑中医院/暨南大学医学院第六附属医院 药学部,广东 江门529000；

2.江门市五邑中医院/陈皮研究院,广东 江门529000；3.广东药科大学,广东 中山528400)

散瘀止痛膏为我院骨科院内制剂,是有40余年历史的骨伤科临床经验方,有较好的活血、祛瘀和消肿止痛的治疗效果,临床主要用于治疗跌打损伤早、中期瘀肿疼痛等外伤。原处方为大黄、两面针、千里光等五种药材制成粉末后与凡士林混合制成软膏,供临床患者外敷或涂抹使用。在长期使用过程中发现此膏剂存在难以清洗、涂展不便、生物利用度低等缺点,故决定对其进行剂型改革：以亲水性高分子聚合物作为载体,研制成新剂型——散瘀止痛凝胶膏剂,以改善其应用中的诸多缺点[1]。目前,新剂型正在进行临床测试。同时为有效控制新制剂的质量,本研究采用薄层鉴别色谱法对方中主要药物大黄、两面针进行定性鉴别；采用高效液相色谱法对大黄中有效成分进行含量测定,旨在为新剂型建立简便可行的质量标准控制方法。现将研究过程报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

TC-15套式恒温器(海宁市新华医疗器械厂)；WH-800超声波清洗机(济宁万和超声电子设备有限公司)；电热鼓风干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司)；SP-II型电动薄层点样器(上海科哲生化科技有限公司)；HH-3A数显恒温三温水浴锅(金坛市精达仪器制造有限公司)；ME104电子分析天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司)；WFH-203B三用紫外分析仪；Agilent Technologies 1260 Infinity Ⅱ系列高效液相色谱仪(美国)；Shim-pack VP-ODS

C18色谱柱(250 L×4.6 mm,5μm)；硅胶G薄层板(自制)。

1.2 试药

散瘀止痛凝胶膏剂(批号：20180117,20180118,20180119)及缺味阴性对照样品由我院药学部自制；大黄酸对照品(批号：MUST-17021310)购自中国科学院成都生物研究所；大黄药材购自广州市集芝宝中药有限公司(批号：201708001)；硅胶G(批号：20161123)购自青岛海洋化工有限公司；甲醇为色谱纯(欧普森公司)；正己烷、乙酸乙酯、甲酸、二氯甲烷、石油醚(60～90℃)为分析纯。

2 大黄薄层色谱鉴别

取本品20g,揭去盖衬后,将其剪切成宽约0.5 cm的条块状,置于具硅胶塞的三角瓶中,加80 m L甲醇浸泡1h,超声处理30 min,用定性滤纸滤过,将滤液蒸干,加蒸馏水10 m L使残渣溶解,再加入1 m L盐酸,在恒温水浴锅中加热回流30 min,冷却,转移至分液漏斗中,用乙醚萃取2次,每次20 m L,合并两次乙醚液,挥干溶剂,加1 m L甲醇使残渣溶解,作为供试品溶液。另取大黄对照药材5 g,置于具硅胶塞的三角瓶中,大黄对照药材的处理依照供试品溶液的制备方案制备,作为大黄对照药材溶液。照薄层鉴别色谱法(附录ⅣB)点样,吸取上述溶液各10μL,点在同一块以羧甲基纤维素钠(CMC-Na)为黏合剂的硅胶G薄层板上,以正己烷-乙酸乙酯-甲酸(12∶4∶0.4)为展开剂,预饱和15 min,展开距离为15 cm,取出,晾干,最后置于紫外光灯(365 nm)下检视,结果见图1。

3 含量测定

3.1 色谱条件与系统适应性条件

Shim-pack VP-ODS C18色谱柱(250 L×4.6 mm,5 m)；流动相：甲醇(A)-0.2%磷酸(B),梯度洗脱(0～30min：70%A～85%A；30%B～15%B)；流速：1.0m L/min；检测波长：254 nm；柱温：25℃；进样体积：20μL。理论塔板数按大黄酸峰面积计算应不低于3 000。取大黄酸对照品溶液、散瘀止痛凝胶膏剂供试品溶液和阴性缺大黄对照溶液,依照上述色谱条件进样检测,发现大黄酸对照品溶液与散瘀止痛供试品溶液在一致的保留时间处均出现了大黄酸的吸收峰,缺大黄的阴性对照溶液在对应的保留时间处无吸收峰。检测结果表明,大黄酸的色谱峰分离度良好,R＞1.5。见图2、图3、图4。

图1 大黄的薄层色谱

3.2 对照品溶液的制备

精密称定适量的大黄酸对照品,加入甲醇制成每1 m L含有0.023 mg的大黄酸对照品溶液,摇匀即得。

3.3 供试品溶液的制备

精密称取散瘀止痛凝胶膏剂5 g,加甲醇30 m L,水浴加热回流30min,放冷,用定量滤纸滤过,用少量甲醇洗涤滤纸和滤器,合并滤液置于50 m L棕色容量瓶中,定容,密塞,摇匀,吸取上述母液25 m L,蒸干,残渣加8%盐酸25 m L,超声处理10min,加二氯甲烷25m L,加热回流1h,放冷后转移至分液漏斗中,静置分层,重复萃取3次,合并下层液,回收有机溶剂,加甲醇溶解残渣并稀释至10 m L,密塞摇匀,过0.45μm滤膜,即可。

3.4 阴性对照溶液的制备

按方中比例称取缺大黄的各味药材,按照散瘀止痛凝胶膏剂的提取工艺和制备工艺制成不含大黄的散瘀止痛凝胶膏剂,依“3.3”项的制备方法制备缺大黄阴性对照溶液。

图1 大黄酸对照品溶液

图4 散瘀止痛凝胶膏剂阴性对照品溶液(缺大黄)

3.5 线性关系考察

分别精密吸取大黄酸对照品溶液1、5、10、20、25、30μL,依“3.1”项进样测定,记录不同进样体积下的峰面积,以峰面积(Y)和进样量(X)进行线性回归,得出大黄酸的标准曲线为：Y=513.8607X+3.1332(r=0.999 9)。结果表明大黄酸在进样量0.23～1.38μg范围内有良好的线性关系。

3.6 精密度试验

精密吸取同一大黄酸对照品溶液,依照“3.1”项进样检测,连续进样6次,测定每次进样后的大黄酸峰面积,经计算得出RSD为0.6%,结果表明仪器的精密度良好。

3.7 稳定性试验

精密吸取同一批次散瘀止痛凝胶膏剂供试品溶液,依照“3.1”项进样检测,将样品溶液分别放置0、2、4、8、16、24 h后进样检测,检测不同放置时间下的峰面积,计算大黄酸含量,结果RSD为1.74%,表明供试品溶液能在24 h内维持稳定状态,有较好的稳定性。

3.8 重复性试验

称取同一批次散瘀止痛凝胶膏剂6份,依照“3.3”项制备方案制成供试品溶液,依照“3.1”项进样检测,测得供试品溶液中大黄酸平均含量,经计算得出重复性试验的RSD为1.18%,表明试验方法有良好的重复性。

3.9 加样回收率试验

称取同一批次已知含量的散瘀止痛凝胶膏剂6份,精密称取5 g,分别置于磨口三角瓶中,精密加入适量的大黄酸对照品溶液,依照“3.3”项的制备方法制成供试品溶液,依照“3.1”项进样检测,测定大黄酸的峰面积,经计算得出回收率RSD为1.25%,标明试验方法加样回收率较优。结果见表1。

表1 加样回收率试验结果

3.1 0 样品含量测定

取10批散瘀止痛凝胶膏剂样品(批号：20171010、20171013、20171014、20180117、20180118、20180119、20180420、20180421、20180623、20180624),依照“3.3”项下供试品溶液的制备方法制成3批样品溶液,按“3.1”项进样测定。结果见表2。

表2 含量测定结果

4 讨论

本实验在大黄酸的含量测定中原采用药典方法,即等梯度洗脱[2],但由于供试品中目标峰与杂峰分离度低,且峰型不佳,因此尝试甲醇(A)-0.2%磷酸(B),梯度洗脱(0～30min：70%A～85%A；30%B～15%B),并且加大磷酸浓度以调整其峰型,最终得到含量测定方法。

此外,本实验在凝胶膏剂供试品溶液处理过程中考察了样品提取时是否采用萃取。结果表明,未经过萃取的溶液里面含有部分膏剂基质,且含有的杂质较多,导致在点样时容易堵塞毛细管,严重影响点样的操作,因此笔者认为对于凝胶膏剂、凝胶剂等以高分子聚合物为基质的制剂,在提取制备供试品时,最好有适当的萃取步骤,以纯化样品,方便点样和分析。