通过ITS技术对不同来源辽细辛进行鉴别

刘洋洋,赵 容,梁一凡,殷楚璇

(辽宁中医药大学 中药学,辽宁 大连116600)

r DNA ITS序列是近年来使用的重要分子标记技术之一,主要用于探讨植物种内变异和种间、近缘属间分子系统关系,在不同植物类群中的应用价值不同,具有鉴别快速、灵敏、微量、准确率高等特点,具有非常广阔的发展前景。内部转录间隔区(internal transcribed spacer,ITS)[1]序列由于具有在种属水平的变异度较大、片段较小、易PCR扩增、易分析、物种鉴定成功率高等优点,被广泛应用于植物类药材的鉴别[2]。本研究将该序列用于细辛属植物分子鉴定,同时进行了细辛属植物物种间的亲缘关系比较研究,为其种类鉴定提供了新的科学方法,为后续细辛药材的鉴定提供一定的科学依据。

r DNA的内部转录间隔区(ITS)：rDNA是编码核糖体DNA的基因,在植物中以重复连续排列方式存在,包含进化速率不等的编码区、非编码转录区和转录区,可选择较保守的片段如18S、5S的r DNA进行各种亲缘关系的研究。ITS在核糖体DNA中位于18S与26S基因之间。中部被5.8S基因分割为ITS1和ITS2两个片段。该片段一般适用于研究被子植物属、种级甚至居群间的系统关系,在被子植物中ITS的长度为187～298bp,ITS2为187～252bp[3]。

细辛是一味常用中药,其中《中华人民共和国药典》[4](2015年版一部)规定,细辛来源为马兜铃科植物北细辛Asarum heterotropoides Fr.Schmidt val.Mandshuricum(Maxim.)Kitag.、汉城细辛Asarum sieboldii Miq.var.seoulense Nakai或华细辛Asar.,具有祛寒解表、散寒止痛、温肺化软、宣通鼻窍的功效[5]。味辛,温,入肺、肾经。《本草纲目》[6]记载：“细辛,辛温能散,故诸风湿风寒头痛、痰饮、胸中滞气、惊痫者,宜用之。口疮、喉痹、匿齿诸病用之者,取其能散浮热,亦火郁则发之之义也。”细辛的产地,最早见载于《名医别录》,谓“生华阴”[7]。

本文使用ITS的方法,对不同来源的辽细辛进行种内鉴别,以表明ITS序列可以对细辛原植物进行鉴别,且在近缘物种鉴定方面具有较大应用价值。ITS序列分析技术因其准确、可靠、方便等优点备受人们的关注和推崇[8]。

1 方法与材料

1.1 方法

1.1.1 辽细辛DNA的提取 选取硅胶干燥的叶片约30 mg,研磨粉碎,使用天根植物基因DNA提取试剂盒(离心柱型)提取总DNA,严格按照试剂盒流程操作。

1.1.2 总DNA PCR的扩增 扩增引物ITS序列包括正反2个方向,正向引物ITS5F：5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAAGG-3'；反向引物ITS4R：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'。PCR反应体系为50μL：含有正反引物各2.0μL(2.5μmol/L),25μL Tap Master Mix,4.0μL总DNA(约40ng),加RNase-Free Water(17μL)补足至50μL。扩增程序：94℃预变性5 min,94℃变性30s,56℃退火30s,72℃延伸45s(35 cycles),72℃延伸10 min。PCR扩增产物经纯化后采用双向测序。

1.1.3 数据分析 测序后的序列经DNAMAN 8.0软件拼接、校对,使用MEGA 6.0软件进行分析比对,计算遗传距离(K2P)并对数据进行处理。利用邻接法(NJ)构建系统进化树和BLAST进行序列比对,鉴定各样本[9-10]。

1.2 材料

样本情况见表1。

表1 样本来源及ITS序列GenBank登录号

2 结果与分析

2.1 ITS序列物种鉴定分析

细辛属20个样本ITS序列的PCR扩增琼脂糖凝胶电泳总DNA提取成功率100%；ITS序列的细辛属20个样本扩增成功率100%；测序成功率100%。对测序所得峰图分析可知,各序列的碱基质量值均大于20。

图1 样本基于ITS序列变异位点

2.2 种内和种间变异

细辛属24个样本ITS2序列长度为470～490 bp。应用MEGA 6.0软件进行序列比对,不同物种间信息位点有645个,碱基变异位点有228个,见图1。ITS序列种间遗传变异(0.586～0.616)大于细辛属植物的种内遗传变异(0.000～0.020),见图2。

图2 样本基于ITS序列变异的K2P遗传距离

3 讨论

3.1 细辛植物基原亲缘关系

本实验NJ树显示辽宁省铁岭市西丰县、抚顺县等5个产地同一来源的细辛在亲缘关系形成稳定的分支,支持率达99%,两属4个物种的26个样本被聚为3大支。细辛植物自成1支,汉城细辛属1支,马兜铃属植物1支。在细辛植物一支中,辽宁省铁岭市西丰县、抚顺县、新宾县、清原县与本溪桓仁县的ITS序列种内变异明显,分为3小支。从Genbank中下载的马兜铃属2个样本与细辛属容易区分,单独聚为1支。而且ITS序列长度与NCBI数据库一致也支持该分支为亲缘关系很近的稳定类群,和其他细辛属植物有明显区别(如图3)。

图3 样本基于ITS序列构建的NJ系统聚类树

3.2 汉城细辛的分类位置探讨

有人认为汉城细辛是华细辛的变种或变型A.sieboldii var.seoulense、A.sieboldii f.seoulense,从NJ树及K2P遗传距离分析,汉城细辛与北细辛遗传距离为(0.586～0.616),达到种间变异,支持汉城细辛作为单独的种,由于汉城细辛与北细辛植物形态差异较小,因此,通过DNA条形码技术可以区分二者。