怀菊总黄酮提取工艺优化及不同花期总黄酮积累规律研究

夏 伟,谭政委,梁慧珍,余永亮,杨红旗,许兰杰,董 薇

(河南省农业科学院 芝麻研究中心,河南 郑州450002)

怀菊是我国常用大宗药材之一,2015版《中国药典》记载怀菊为菊科菊属植物菊(Chrysanthemum morifolium Ramat.)的干燥头状花序,具有疏散风热、清肝明目、清热解毒的功效,常用于用于风热感冒、头痛眩晕、目赤肿痛,眼目昏花[1]。怀菊中含有黄酮类、萜类及有机酸类等活性化合物,其中的黄酮类化合物包括黄酮类、黄酮醇、二氢黄酮类等,具有抗氧化、抗炎、镇痛、调节免疫、抗衰老、降血脂、抗肿瘤等药理作用[2-3]。怀菊主产于安徽、河南、浙江、河北、湖北等地,且2015版《中国药典》药用怀菊记录怀菊入药为“毫菊”“滁菊”“贡菊”、“杭菊”“怀菊”5个品种,主要以栽培为主,市场需求量较大[4]。目前许多科研工作者的研究主要集中在怀菊的药理学活性成分分析上。本研究以怀菊为材料,优化怀菊总黄酮的提取工艺,比较开花时期怀菊的总黄酮积累规律,以期为怀菊质量控制及采收加工提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

怀菊及不同花期怀菊均采自河南省农业科学院现代农业研究开发基地(N 35°0'36″,E 113°42'24″),经河南省农业科学院芝麻研究中心药用植物研究室梁慧珍研究员鉴定为菊科植物怀菊。不同花期确定根据其采收时怀菊开放程度共分为5个时期。见表1。

表1 怀菊不同花期性状

芦丁对照品(国药集团化学试剂有限公司,批号：20160725,纯度＞95%),无水乙醇(天津四友化学有限公司,分析纯),无水三氯化铝(天津市风船化学试剂科技有限公司,分析纯),亚硝酸钠(天津市大森化工产品销售有限公司,分析纯),氢氧化钠(天津市华东试剂厂,分析纯)。

美谱达UV-3200紫外分光光度计(上海美谱达仪器有限公司),KQ3200DE数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 溶液配制 对照品溶液配制：精密称取经过120℃干燥至恒重的芦丁标准品0.020 7g,用甲醇定容至100 m L,配制成浓度为0.207mg/m L的标准应用液。供试品溶液配制：称取0.250 0 g怀菊粉末(四号筛),精密加入70%乙醇溶液25m L,超声(105W,40k Hz)条件下超声35 min,过滤即得。

1.2.2 测定方法的建立 优选测定方法[7-9]：本实验主要对NaNO3-AlCl3、AlCl3、KOH和直接法对怀菊总黄酮进行测定。

波长筛选：在相同样品处理条件下,利用全波长扫描,扫描每种方法项下的标准液和样品液,综合确定每种方法最优波长。

NaNO3-AlCl3法：精密吸取0.5 m L样品溶液,置于10 m L具塞试管中,加70%乙醇至5 m L,加入0.3 m L,5%NaNO3溶液,摇匀,静置6 min,后续加入0.3 m L,10%AlCl3溶液,摇匀,静置6 min,最后加入4 m L,1.0 mol/L NaOH溶液,分别用70%乙醇稀释至刻度,摇匀静置15min,于510nm下测定吸光度值。

AlCl3法：精密吸取0.5m L样品溶液,置于10m L具塞试管中,加入2%AlCl3溶液1m L,用70%乙醇稀释至刻度,静置20min,分别于300 nm和410 nm条件下测定吸光度值。

KOH法：精密吸取1m L样品溶液,置于10m L具塞试管中,用70%乙醇稀释2m L,加10%KOH溶液0.5m L,充分混匀,静置显色5 min,用70%乙醇稀释至刻度,于280 nm、340 nm和410 nm条件下测定吸光度值。

直接测定法：精密吸取0.5 m L样品溶液,置于10 m L具塞试管中,用70%乙醇稀释至刻度,充分混匀,静置5 min后于306 nm和358 nm条件下测定样品吸光度值。

1.2.3 怀菊总黄酮提取工艺优化[10-11]

单因素考察：称取怀菊粉末(过四号筛)0.25 g,放入100 m L具塞玻璃锥形瓶中,指定工艺中一项指标变化,其他指标相同的条件下,进行单因素考察。每个样品重复3次,样品提取液经过滤、定容后测定其吸光度,计算怀菊样品总黄酮与样品重量的质量比,考察单因素对怀菊总黄酮提取效果的影响。正交试验设计[10]：

根据单因素的试验结果,选取对怀菊中总黄酮的提取效果影响较大的溶剂料液比、乙醇浓度、超声时间、超声功率4个影响因素,进行4因素3水平的正交试验设计,见表2。

表2 怀菊总黄酮提取工艺条件的正交试验设计

1.2.4 不同花期总黄酮积累规律研究[5-6]选取正交设计优化的提取工艺,测定不同花期、不同部位总黄酮含量,考察不同花期总黄酮积累规律。

2 结果与分析

2.1 测定方法

在料液比为1∶100,乙醇浓度为50%,超声功率为90 W,超声20 min条件下,在对应波长吸收峰条件下,对NaNO3-AlCl3、AlCl3、KOH和直接法对怀菊总黄酮进行测定,结果见图1。由结果可知,在310 nm条件下AlCl3测定条件测定含量最优,因此选择AlCl3在310 nm条件为怀菊总黄酮测定方法。

图1 不同测定方法含量结果

2.2 提取工艺条件对怀菊总黄酮提取效果的影响

2.2.1 单因素对怀菊总黄酮提取效果的影响 乙醇浓度：本实验选用常规试剂乙醇,在料液比为1∶100,超声功率为90 W,超声时间20 min条件下对不同体积分数的乙醇提取试剂提取怀菊总黄酮。由图2可知,乙醇浓度为80%时对怀菊总黄酮的提取效果最好,浓度再增加提取效率降低。

图2 乙醇浓度对怀菊总黄酮提取效果的影响

料液比：在功率为90 W,超声时间20 min,乙醇浓度为80%条件下考察不同料液比提取怀菊总黄酮的影响,结果见图3。由结果可知,不同料液比提取效率有差异,在1∶30～1∶150条件下提取效率逐渐升高,之后开始降低,因此选择料液比为1∶150。

图3 料液比对怀菊总黄酮提取效果的影响

超声时间：在功率为90 W,乙醇浓度为80%,料液比为1∶150条件下考察超声时间对提取怀菊总黄酮的影响,结果见图4。由图4结果可知,随着超声时间的延长,怀菊总黄酮提取效率呈现上升趋势,至30 min效果最好,随后开始降低,因此选择超声时间为30 min。

超声功率：超声功率的变化可明显影响植物有效成分的溶出。因此在乙醇浓度为80%,料液比为1∶150,超声时间30min条件下考察超声功率对提取怀菊总黄酮的影响,结果见图5。由结果可知,在超声功率为105 W条件下总黄酮提取效率最高,因此选择超声功率为105 W。

图4 超声时间对怀菊总黄酮提取效果的影响

图5 超声功率对怀菊总黄酮提取效果的影响

2.2.2 桑白皮总黄酮提取工艺条件的优化 在单因素试验的基础上,本实验选择提取试剂浓度、料液比、超声功率、超声时间为考察因素,采用4因素3水平的正交设计对怀菊总黄酮提取工艺进行优化,结果见表3。由表3中实验数据及极差R的大小可判断出4个因素对怀菊总黄酮提取效果因素影响的主次顺序为：料液比 ＞ 乙醇浓度 ＞ 超声功率 ＞ 超声时间。因此最佳提取工艺条件为A1B2C3D2组合,即料液比1∶100,乙醇浓度80%,超声时间40 min,超声功率105 W。在此工艺条件下提取怀菊总黄酮样品的质量比为16.6188 mg/g。

表3 怀菊总黄酮提取工艺条件的L 9(34)正交试验结果

2.2.3 不同花期怀菊总黄酮积累规律 S1～S5五个时期怀菊总黄酮有表4和图6可知,S1～S5五个时期总黄酮含量差异显著,且怀菊花蕾期总黄酮含量较高,达到16.5701mg/g,随着怀菊逐渐开放,至S3时期怀菊总黄酮含量一直减少,S4期怀菊达到盛开期,总黄酮含量又显著的增加,此时含量为15.826 4 mg/g,随着怀菊开始枯萎,其总黄酮含量又开始下降。由S1～S5不同时期怀菊总黄酮积累曲线可知,怀菊总黄酮在其生长阶段总黄酮含量也在时刻变化,有升有降,且在怀菊采收期阶段又有一个显著的积累过程,这也与传统怀菊采收期结论一致。

表4 怀菊S1～S5总黄酮含量 (±s,mg/g)

表4 怀菊S1～S5总黄酮含量 (±s,mg/g)

注:小写字母表示P＜0.01。

花期 总黄酮S1 16.5701±0.0316a S2 14.5253±0.02193b S3 14.3803±0.2286c S4 15.8264±0.0031 d S5 14.7894±0.1345e

图6 怀菊不同花期总黄酮积累曲线

3 讨论

怀菊在我国栽培历史悠久,药用价值突出,是河南产区著名的四大怀药之一,亦是传统中药材怀菊的重要来源之一。因此,本研究主要选取具有代表性的怀菊品种小黄菊为实验材料,在对4种紫外分光光度测定方法的对比中,获得怀菊总黄酮最佳方法是300nm条件下AlCl3测定法；在单因素试验的基础上通过正交试验设计,获得怀菊总黄酮的最佳提取工艺条件为料液比1∶100,乙醇浓度80%,超声时间40min,超声功率105W；根据怀菊开放程度的不同,将怀菊划分为5个时期,在对5个时期总黄酮含量测定中发现,怀菊不同时期总黄酮积累程度差异明显,且在盛花期时总黄酮有一个明显的积累过程。

目前总黄酮提取技术较为成熟,但在怀菊的应用上较为少见。另外在紫外分光光度法分析测定总黄酮时测定方法较为单一,很少有几种方法进行对比优选。怀菊黄酮类成分是其有效成分,怀菊在其开放过程中,花颜色的变化、花开放的程度以及花的香味等都有变化,变化过程中怀菊总黄酮含量的变化是否与其有关,值得后期进一步研究。