桔梗中三萜总皂苷含量测定及其抗氧化活性研究

李彦灵,陈小敏,吴振静,康亚楠,吴凯凯,闫福林

(新乡医学院三全学院,河南 新乡453003)

桔梗为桔梗科多年生植物桔梗Platycodon grandiflorus(Jacq.)A.DC.的干燥根[1],首见于《神农本草经》,又名苦桔梗。桔梗广泛生长于中国、朝鲜半岛、日本和西伯利亚东部,是我国药食同源的植物之一,在我国东北和华北地区广泛种植。桔梗性平,味苦、辛,归肺经,具有化痰止咳、宣畅肺气、祛痰排脓、降血糖之功效,可用于治疗外感、咳嗽、咽喉肿痛、肺痈吐痰胸闷腹胀、血淤水肿等症,是一种很好的保健食品[2]。研究表明,桔梗富含皂苷、多糖、黄酮、酚酸、甾醇、聚炔、挥发油等成分[3]。本文主要研究桔梗中三萜总皂苷的含量及其抗氧化能力,三萜皂苷具有抗炎、保肝、抗肿瘤、抗凝血、抗病毒、降低胆固醇等作用[4-5]。本文以熊果酸为对照品,采用紫外分光光度法测定总三萜含量；利用Vc作为对照品研究桔梗提取物对DPPH自由基的清除率。

1 材料与仪器

1.1 实验材料

桔梗于2017年8月采自河南省辉县万仙山景区,经新乡医学院三全学院苏慧慧老师鉴定为桔梗科桔梗。熊果酸购自中国食品药品检定研究院,批号：110742-201622；Vc、DPPH、高氯酸、为优极纯；香草醛冰乙酸、甲醇、无水乙醇均为分析纯。

1.2 实验仪器

T6新世纪紫外可见分光光度计,北京普析通用仪器有限公司；FA2004电子F分析天平,上海良平仪器仪表有限公司；HH恒温水浴锅,金坛市中大仪器厂；旋转蒸发仪(R206),上海申生科技有限公司；SHZ-3循环水式多用真空泵,CCA-420低温冷却水循环泵,郑州杜普仪器厂。

2 方法与结果

2.1 供试品溶液的配制

取桔梗药材粉碎,过4号筛,备用。精密称取桔梗粉末2.0g,共5份。60%的乙醇100 m L回流提取3次,每次1.0 h,过滤,合并三次滤液,减压回收溶剂至干,甲醇溶解,定容至25 m L容量瓶中,备用。

2.2 标准溶液的配制

精密称取熊果酸对照品适量,置于25 m L容量瓶中,甲醇溶解,定容至刻度,即得浓度为0.079 2 mg/m L的对照品溶液。

2.3 标准曲线的绘制

分别精密量取“2.2”项下制备的标准溶液0.0、0.6、0.8、0.9、1.4 m L置试管中,100℃水浴蒸干甲醇,分别加入0.2m L香草醛-冰乙酸、1.0 m L高氯酸,在60℃水浴加热20 min后,放置于冰水浴中5 min后加入5.0 m L冰乙酸,摇匀,放置10min,在545nm处测定吸收值,结果见图1。以浓度X为横坐标,吸光度Y为纵坐标进行线性回归,得标准曲线方程：Y=0.039X-0.003,r=0.999 9。

图1 标准曲线

2.4 方法学考查

2.4.1 重复性试验 精密称取同一样品2.0g,按“2.1”项下制备样品溶液,精密吸取供试品溶液1.0 m L,按"2.3"项下自“置试管中”开始操作,在545 nm处测定吸收值,RSD为4.74%。结果见表1。

表1 桔梗三萜总皂苷含量测定重复性试验结果

2.4.2 稳定性试验 精密称取同一样品2.0 g,按“2.1”项下制备样品溶液,精密吸取供试品溶液1.0 m L,按“2.3”项下自“置试管中”开始操作,分别在0、30、60、90、120 min测定其吸光度值,RSD为5.04%。结果见表2。

表2 桔梗三萜总皂苷含量测定稳定性性试验结果

2.4.3 加样回收率试验 取同批次桔梗药材1.0 g,共6份,精密称定,分别精密加入对照品溶液1.0 m L,按“2.1”项下制备样品溶液,精密吸取供试品溶液1.0 m L,按“2.3”项下自“置试管中”开始操作,测定各样品的吸光度值,RSD值为3.07%。结果见表3。

2.5 总三萜含量测定

精密吸取供试品溶液1.0 m L,按 “2.3”项下“置试管中”开始,在545 nm测定其吸光度,运用回归方程计算样品中三萜总皂苷含量。结果见表4。

表3 桔梗三萜总皂苷含量测定加样回收率试验结果

表4 桔梗总皂苷含量测定结果

2.6 抗氧化能力测定

2.6.1 溶液的配制 根据参考文献[6]的方法,精密称取13mg的DPPH,无水乙醇溶解定容至50m L容量瓶中,取2 m L在波长517 nm处测定吸光度(A0)。

2.6.2 Vc标准曲线制备 精密称取Vc对照品适量,无水乙醇溶解,依次稀释成0.39、1.17、2.34、3.12、4.68、6.24、7.8、10.92、14.04、18.72、23.4、31.2μg/m L的溶液,按顺序依次各吸取2.0 m L溶液置于2支试管中,各加入2.0 m L

DPPH、2.0 m L无水乙醇溶液,室温避光反应30 min,517 nm测定吸光度A1、A2。

2.6.3 样品抗氧化能力测定 根据 “2.1”项下方法将桔梗药材配制成78μg/m L的样品液,依次吸取1、3、6、8、12、16、20、28、36、48、60、80 m L至100 m L容量瓶中,无水乙醇定容至刻度,按“2.6.2”项下“按顺序依次各吸取2.0 m L溶液”开始测定,计算样品的抗氧化能力。结果见图2。

图2 抗氧化能力结果

3 讨论

DPPH指的是1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical 2,2-diphenyl-1-(2,4,6-trinitrophenyl)hydrazyl,DPPH),可用于体外评价和筛选物质抗氧化活性,该方法有稳定性好、灵敏度高、操作简单等优点[7-8]。DPPH的乙醇溶液显紫色,在517nm波长处有特征吸收峰,当在其乙醇溶液中加入自由基清除剂时,其孤电子被配对,溶液颜色变浅,使其在517nm波长处的吸光度变小,其吸光度的变化用于评价天然产物对自由基的清除能力,通常用清除率表示,清除率越大,表明该物质清除DPPH的能力越强[9]。

王晓林等[10]研究桔梗茎总黄酮的抗氧化效果,当桔梗茎提取物总黄酮含量在0.6mg/m L时对DPPH自由基清除率为84.60%,该结果与同浓度的Vc溶液相差不大,表明桔梗茎提取物总黄酮具有一定的体外抗氧化活性。朴向民等[11]对桔梗不同部位的体外抗氧化活性进行了研究,发现桔梗叶体外抗氧化能力最强,有望作为天然抗氧化剂原料加以开发利用。而桔梗的花、茎与根皮也表现了相对较高的抗氧化活性。而另一项报道[12]对不同产地桔梗进行抗氧化研究发现桔梗多糖对DPPH和OH自由基均有清除作用,且产于安徽的桔梗作用最强；桔梗醇提物对自由基的清除作用均强于水提物和桔梗多糖的抗氧化作用。

本文采用DPPH法对桔梗药材进行了体外抗氧化活性研究,发现桔梗药材有一定的清除DPPH自由基的能力,样品浓度在31.2μg/m L时,清除率达到91.9%,接近Vc清除自由基的能力。结果表明,桔梗具有较强的自由基清除能力,说明桔梗药材具有一定的体外抗氧化活性。上述试验结果可为桔梗的开发利用提供基础依据。