黄芩与生姜相恶配伍物质基础研究

刘 娜,杨应勇,华光红

(1.贵阳中医学院,贵州 贵阳550002；2.贵州神奇药物研究院,贵州 贵阳550002)

相恶是中药七情配伍的重要组成部分,其定义为两种药物合用发生相互作用而致使原有功效降低,甚至丧失[1]。相恶配伍最早见于汉代《神农本草经》：“勿用相恶相反者。”[2]由于《神农本草经》并没有对相恶作出明确的解释,故后世医家对相恶涵义的理解存在差异。梁代陶弘景在《本草经集注·序例》中首先解释七情,并以“今按其主疗虽同,而性理不和,更以成患……虽尔,恐不如不用”之语论述相恶相反[3]。联系《神农本草经》之“勿用”以及《本草经集注》之“不如不用”可推断,此处“所制伏者”,当不是药物毒性[4]。此后,历代医家多从药物效能制约方面理解相恶。

《备急千金要方》中竹叶黄芩汤、《伤寒论》中小柴胡汤,《金匮要略》中泽漆汤、《外台秘要》中柴胡桂枝汤等均合用了黄芩、生姜。按照传统药性理论分析,所谓“生姜恶黄芩”主要是因为二者寒温相对,生姜辛温发散,而黄芩苦寒降泄,二药合用,导致生姜的温肺、温胃牵制黄芩的清肺、清胃功效,而其他功效不受影响。其理论分析是否作为配伍禁忌也有所争议,缺少必要的量化标准来证实。鉴于此,本实验通过HPLC法测定黄芩与生姜不同配伍比例下黄芩中黄芩苷的溶出量,以探讨黄芩与生姜相恶配伍变化的物质基础。

1 仪器与材料

1.1 仪器

岛津高效液相色谱仪(SPD-20A检测器、LC-20AT泵、SIL-20A自动进样器、CTO-10AS柱温箱)；分析天平(上海民桥精密科学仪器有限公司,JA10003N)；纯化水处理器(艾科浦,AHL-0501-P)；超声波震荡仪 (CLB Model9960A)；光波炉(小鸭TA-816)；离心机(上海安亭科学仪器厂,Anke TDL-5-A)。

1.2 药品与试剂

黄芩苷对照品(中国食品药品检定研究院,批号110715-200815)；乙腈(色谱纯)；甲醇(分析纯)；磷酸(分析纯)；黄芩和生姜(贵州神奇制药有限公司,根据2010版《中国药典》规定,检测合格)；超纯水(纯化水处理器取用)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱：Diamonsil C18(2)(250mm×1.6mm,5μm)；流动相：乙腈-0.4%的磷酸溶液(V/V)(24∶76)；流速：1.0 m L/min；柱温：30℃；检测波长：280 nm。黄芩苷主峰与各杂质峰分离度大于1.5,理论塔板数不低于2 000。

2.2 对照品溶液制备

精密称取黄芩苷对照品适量,加甲醇制成每1 m L含黄芩苷40μg 的溶液,摇匀,即得。

2.3 供试品溶液制备

取黄芩粗粉9.0g与生姜18.0g,置于同一圆底烧瓶中,加入8倍量的沸水,直火回流2 h,放冷,取出,离心(3500 r/s)5min ,取上层清液置于250m L量瓶中,用水稀释至刻度,摇匀,精密量取5.0 m L溶液,置于25 m L量瓶中,用甲醇稀释至刻度,摇匀,过0.45μm微孔滤膜,即得。

2.4 阴性样品溶液制备

按供试品的制备方法制得缺黄芩的阴性样品溶液。

2.5 专属性考察

按照上述色谱条件,依次吸取对照品溶液、供试品溶液、阴性样品溶液各10μL,分别进样。观察色谱,在对照品溶液和供试品溶液色谱图相应位置上,有相同保留时间的色谱峰,而阴性样品溶液在此无干扰,表明本方法专属性强。见图1、图2、图3。

图1 黄芩苷对照品溶液色谱

2.6 线性关系考察

精密称取黄芩苷对照品20.02 mg,置于100 m L量瓶中,用甲醇稀释至刻度,制成每1 m L含黄芩苷0.200 2 mg的对照品溶液。分别取对照品溶液0.5 m L、1.0 m L、2.0 m L、3.0 m L、5.0 m L置于10 m L量瓶中,用甲醇稀释至刻度。取10μL注入液相色谱仪,测定色谱峰峰面积。以色谱峰面积为纵坐标,浓度为横坐标绘制标准曲线,计算回归方程为：y=3E+06x-35099,r=0.99999(n=5)。表明在本条件下,黄芩苷在0.01001～0.1001mg/m L浓度范围内与峰面积线性关系良好。

图2 样品溶液色谱

图3 阴性样品溶液色谱

2.7 精密度考察

取供试品溶液,注入液相色谱仪,进样体积为10μL,连续进样6次,计算得峰面积RSD为1.08%,表明仪器精密度良好。

2.8 稳定性试验

取同一供试品溶液,分别于放置0 h、2 h、3 h、6 h、8 h和24 h后进样,进样量为10μL,计算得峰面积RSD为0.75%,表明供试品溶液在24 h内稳定性好。

2.9 重复性试验

精密取供试品,平行处理6个样品,依次注入液相色谱仪,进样量为10μL,计算黄芩苷含量。结果峰面积RSD为1.69%,表明方法重复性良好。

2.1 0 加样回收率试验

精密量取样品溶液2.5 m L,置于25 m L容量瓶中,共9份,分别按照供试品中含黄芩苷的量与加入黄芩苷对照品浓溶液(浓度为0.4004mg/m L)的比例1∶0.8,1∶1,1∶1.2各制备3份,按照供试品制备方法制备,于“2.1”项色谱条件下测定。结果表明平均回收率和RSD均符合要求。具体数据见表1。

2.1 1 样品含量测定

按照“2.3”项下方法制备4种不同黄芩与生姜取样量比例(9∶0,9∶4.5,9∶9,9∶18)的供试品溶液,各取10μg注入色谱仪,进行含量测定,测得黄芩中黄芩苷的含量结果见表2。

表1 黄芩苷加样回收率试验结果(n=3)

2.1 2 方差分析

本试验是考察黄芩与生姜不同配伍比例对黄芩苷的溶出量影响的单因素考察试验。经方差齐性检验,得到4组试验的结果方差齐性,再经单因素方差分析,得到统计结论因F=184413.5904＞F0.01(3,4)=16.69,因此P＜0.01,认为黄芩与生姜的不同配伍比例对黄芩苷溶出量的影响极显著。方差分析见表3。

为客观地得到差异是否有显著意义,对四组结果再用q检验法进行检验。查多重比较的q表得q0.05(4,4)=5.76、q0.01(4,4)=9.17。经计算得到DT(0.05)=0.276、DT(0.01)=0.439,现将4个结果均数两两间差数的绝对值逐个比较,以免不漏不重。q检验见表4。

表2 不同比例配伍黄芩苷含量测定结果 (n=2)

表3 方差分析结果

表4 q检验结果

由表4可以得知,黄芩与生姜的配伍比例在9∶0、9∶4.5、9∶9和9∶18时对黄芩苷溶出量的影响均有极显著性意义。

3 讨论

本研究采用HPLC法测定黄芩与生姜不同配伍比例下黄芩中黄芩苷的溶出量,探讨黄芩与生姜相恶配伍变化的物质基础。结果表明,黄芩与生姜的配伍比例为9∶0(黄芩单煎)、9∶4.5、9∶9、9∶18时,黄芩苷的溶出量分别为50.24mg/g、5.99mg/g、15.79 mg/g、8.14 mg/g。经方差分析,不同配伍比例对黄芩苷的溶出量均具有极显著影响。上述实验结果表明：黄芩与生姜不同配伍比例下黄芩苷溶出量的影响具有较大差异,从微观量化角度阐释了传统药性理论“生姜恶黄芩”的科学内涵。

七情配伍是中药配伍理论的核心内容,用现代微观物质量化标准探讨中药七情配伍理论的科学性,对中医临床用药具有指导作用。