正交法配合药效实验综合优选蛤蚧酒制工艺

刘舒凌,黄馨慧,熊桂玉,张 兵,王晓珊

(1.广西中医药大学,广西 南宁530001；2.广西国际壮医医院,广西 南宁530021)

蛤蚧为壁虎科动物蛤蚧(Gekko gecko Linnaeus)除去内脏的干燥全体,其味咸性平,归肺、肾经,具有补肺益肾、纳气定喘、助阳益精的功效[1]。酒蛤蚧是蛤蚧饮片的形式之一。蛤蚧酒制后质酥易碎,矫臭矫味,可增强补肾壮阳的功效。2015版《中国药典》[2]收载酒蛤蚧饮片的炮制方法为取蛤蚧块,用黄酒浸润,烘干。目前,酒蛤蚧的具体炮制加工技术参数,如加辅料量、烘制温度、烘制时间等,药典中未作规定,全国和省级中药饮片炮制规范的规定亦不统一。本研究拟采用正交试验考察蛤蚧酒制过程中影响成品质量的因素(加辅料量、烘制温度、烘制时间),选取浸出物含量、总蛋白质含量和肾阳虚小鼠药效学指标对蛤蚧酒制工艺进行综合评价分析,以期优选酒蛤蚧饮片的最佳炮制工艺,为酒蛤蚧饮片的规范化生产提供实验依据。

1 材料与仪器

1.1 实验药物

蛤蚧购自广西南宁市浚豪野生动物养殖场,经广西中医药大学中药鉴定教研室田慧教授鉴定为壁虎科动物蛤蚧(Gekko gecko Linnaeus)的原药材。特醇绍兴花雕酒(浙江省塔牌绍兴酒有限公司,批号：20160327)；腺嘌呤(日本Sigma公司,批号A8330)；金匮肾气丸(北京同仁堂制药厂,批号：15042706)。

1.2 实验动物

SPF级昆明种小鼠,雄性,体重28～32g,购自广西医科大学实验动物中心,许可证号：SCXK桂2014-0002。

1.3 实验仪器

DHG-9140A型电热恒温鼓风干燥箱(上海齐欣仪器厂)；BP211D型电子天平(德国赛多利斯公司)；1100型凯氏定氮仪(济南海能仪器公司)。

2 方法与结果

2.1 蛤蚧饮片制备

取蛤蚧原药材,除去内脏,烘干,除去头(齐眼处切除)、足、鳞片,切成小块,即得蛤蚧的生品饮片,备用。

2.2 酒蛤蚧饮片炮制工艺的正交试验设计

取蛤蚧饮片作为实验材料,每份100 g,在单因素考察的基础上,以加酒量、烘制时间、烘制温度为考察因素,设计L9(33)因素水平表。见表1。

2.3 指标性成分含量测定

2.3.1 浸出物含量测定[3]按照《中国药典》醇溶性浸出物测定法(通则2201)项下的冷浸法测定：取酒蛤蚧样品约4g,精密称定,置于250 m L锥形瓶中,精密加稀乙醇100 m L,密塞,冷浸,前6 h内时时振摇,再静置18 h,用干燥滤器迅速滤过,精密量取续滤液20 m L,置于已干燥至恒重的蒸发皿中,在水浴上蒸干后,于105℃下干燥3 h,置于干燥器中冷却30min,迅速精密称定重量,以干燥品计算供试品中醇溶性浸出物的含量(%)。

2.3.2 蛋白质含量测定[4]按照《中国药典》四部蛋白质含量测定法(通则0731)项下的第一法凯氏定氮法测定总氮值,分别乘以换算因子6.25,计算得蛤蚧的总蛋白质含量。

表1 酒蛤蚧炮制因素水平

2.4 对肾阳虚小鼠的影响

2.4.1 酒蛤蚧饮片供试品制备 取正交设计的9份酒蛤蚧生品饮片各50g,剪碎,打粉,研细后过二号筛,备用。

2.4.2 肾阳虚小鼠指标测定 取雄性健康小鼠120只,留取10只作为正常组小鼠,其余110只小鼠每日ig.腺嘌呤[5](100 mg/kg),连续给药7d制备肾阳虚模型。造模成功后,将110只小鼠分为模型组、阳性对照组(金匮肾气丸),9个酒蛤蚧饮片组。正常组和模型组小鼠ig.蒸馏水,阳性组小鼠ig.金匮肾气丸2g/kg；各酒蛤蚧饮片组小鼠ig.相应酒蛤蚧饮片粉末,以蒸馏水稀释,剂量为1 g/kg,连续给药10 d。末次给药后小鼠禁食不禁水,12 h后称取体质量。脱颈椎猝死后,分离小鼠肾脏、睾丸,将肾脏、睾丸用生理盐水洗净,滤纸拍干,于分析天平上称定质量,计算脏器指数(脏器指数=脏器质量/小鼠体质量×1000)。

2.5 实验结果

以测定的浸出物含量、蛋白质含量以及药效指标肾脏指数、睾丸指数作为考察指标,综合加权评分确定酒蛤蚧的炮制工艺。正交试验设计表及结果见表2,方差分析见表3。

表2 酒蛤蚧炮制正交实验安排及结果

表3 蛤蚧酒制综合评分方差分析

由正交试验方差分析结果可知,酒制蛤蚧的影响因素主次大小为C(烘制温度)＞A(加酒量)＞B(烘制时间),烘制温度对结果有显著影响。根据直观分析可确定蛤蚧的最佳炮制工艺为A3B3C1,即蛤蚧饮片加入0.3倍量黄酒(每100g蛤蚧饮片加入30g黄酒),烘制2 h,温度80℃。

2.6 验证试验

按照优选的酒制工艺制备2份样品,测定浸出物含量、蛋白质含量,检测肾阳虚小鼠肾脏指数、睾丸指数,以验证酒制工艺是否可行。结果见表4。

表4 验证实验

由表4可知,2份酒蛤蚧样品中浸出物含量和蛋白质含量均较高,肾脏指数和睾丸指数较好,与正交试验结果吻合,说明本实验优选的酒制工艺可行。

3 讨论

蛤蚧的炮制方法最早见于南北朝的《雷公炮炙论》中,雷公曰：“凡修事,服之去甲上、尾上并腹上肉毛,毒在眼,如斯修事了,用酒浸,才干,用纸两重于火上缓隔焙纸炙。”(净制,酒浸烘焙法)。现代蛤蚧的炮制方法多为净制、酒制,对应的饮片品种为蛤蚧、酒蛤蚧。生蛤蚧的功效以补脾益肺、纳气定喘为主。酒制蛤蚧可增强补肾壮阳的功效,多用于肾阳不足、精血亏损所致的阳痿、五更泄泻、小便频数等病症的治疗[6]。目前国内对蛤蚧的炮制研究主要集中在蛤蚧头、体、尾不同药用部位的化学成分和药效学方面[7-9],而对蛤蚧的炮制工艺研究还未见系统研究与报道。

现代研究表明,蛤蚧的化学成分包括甘氨酸、脯氨酸、谷氨酸等14种氨基酸,钙、磷、锌等18种元素,以及肌肽、胆碱、鸟嘌呤、磷脂等。其药理作用为抗应激、抗炎、增强免疫、平喘、雌性激素样、雄性激素样、延缓衰老等[1]。由于目前蛤蚧的指标性成分尚不明确,在进行质量分析时常以氨基酸含量、浸出物含量为指标成分[9]。然而仅以某些化学成分的高低难以评判炮制工艺的好坏以及揭示炮制的原理和意图。多指标设计将现代有效成分以及药效等多指标结合进行综合评价,是目前研究炮制工艺和原理的常用方法。由于蛤蚧酒制的主要目的为增强补肾助阳功效。本课题在进行炮制品成分含量测定的同时,配合采用肾阳虚动物模型,以成分结合药理指标综合筛选蛤蚧的酒制工艺具有实际意义。根据工艺筛选结果,确立最佳工艺为蛤蚧饮片加入0.3倍量黄酒,润透后,烘制2 h,温度80℃。

虽然规范蛤蚧饮片的炮制工艺具有必要性,但是蛤蚧药材的质量控制也十分重要。实验前期调研发现,市售蛤蚧药材的体型大小、肉质厚薄差异较大,浸出物和蛋白质含量也参差不齐。本实验选取产于广西的蛤蚧鲜药材进行加工炮制,其肉质较厚,含量检测发现其蛋白质含量较高。本试验优选的工艺对于不同产地、不同肉质厚薄之蛤蚧是否适用仍需多样本系统性考察确定,有待进一步实验研究。