时间:2024-06-19
韦美梦,柳俊辉,李耀华,卢澄生,闫理姣,唐冬伟,梁斐琳,雷梦颖,韦乃球
(广西中医药大学,广西 南宁 530200)
糖尿病(Diabetes mellitus,DM)是一组因胰岛素绝对或相对分泌不足和(或)胰岛素利用障碍引起的糖脂代谢紊乱性疾病,病程久可导致眼、肾、神经、心脏、血管等组织器官的功能减退及衰竭等[1]。2型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus,T2DM)为最常见的DM类型,占DM病人的90% 以上[2]。糖尿病肾病(Diabetic nephropathy,DN)是DM最常见的微血管并发症,也是临床常见病、多发病[3]。随着DM和DN发病率的增加,T2DM合并急性肾损伤(Acute kidney injury,AKI)的患者也有所增加,尤其是老年患者更易发生[4-5]。脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)是一种重要的致炎因子,其诱导的脓毒症是AKI的常见诱因[6]。
白子菜Gynuradivaricata(L.)DC.为菊科多年生草本植物,又名白背三七、白仔菜、救命草等[7];其根味甘、性凉,有清热凉血、散瘀消肿之功效;而茎叶味咸、性凉,有清热、舒筋、接骨、止血、祛痰的作用[8]。近年来,老百姓以白子菜食、药两用,广泛用于治疗胃病、高血压病、高血脂症及糖尿病等。已有文献报道白子菜具有改善胰岛素抵抗、降血糖、降血脂、抗氧化、降血压以及保护高血压引起的主要器官损伤等作用[9-22]。但是,白子菜对(T2DM+AKI)模型小鼠的保护效应尚未有相关研究报道。本实验通过建立(T2DM+AKI)小鼠模型,探讨白子菜对(T2DM+AKI)的保护效应,并从炎症反应角度探讨其初步疗效机制,为开发白子菜药用价值方面提供依据。
实验药物采于广西贵港,经广西中医药大学药学院药用植物教研室的郭敏副教授鉴定,为菊科植物白子菜Gynuradivaricata(L.)DC.的全草。
雄性KM小鼠,体质量(20±2)g,SPF级,购自广西医科大学实验动物中心,许可证号为:SCXK(桂)2014-0002。
高糖高脂饲料(由普通饲料69.3%、猪油10%、蔗糖20%、食盐0.5%、胆固醇0.2%组成),课题组自行配制;链脲佐菌素(STZ)(批号:SO130),Sigma;盐酸二甲双胍(批号:180906),上海融禾医药科技有限公司;4%多聚甲醛组织固定液(批号:1810083),广州赛国生物科技有限公司;TNF-α(批号:20190123)、IL-6(批号:20190116)、ICAM-1(批号:20181220),bioswamp。备注:血清BUN、Scr采用的是全自动生化检测,全自动生化检测仪检测试剂采用配套的一体化检测试剂包,没有单独的试剂批号。
ACCU-CHEK罗氏血糖测试仪,罗氏诊断产品(上海)有限公司;UV-1800紫外可见分光光度仪(日本岛津公司);DNM-9602全波长酶标仪(北京普朗新技术有限公司);德国Eppendorf 5430R台式高速冷冻离心机(上海艾研生物科技有限公司);AB204型电子分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司);吉尔森P型移液器(深圳市科力易翔仪器设备有限公司);Aeroset-2000全自动生化分析仪(美国Instrument laboratory公司);MDF-U7386S超低温保存箱(日本 SANYO 公司);电泳仪(美国 BIO-RAD 公司);全自动化学发光分析仪(上海天能公司);电子天平(德国Sartorius公司);BX51T-PHD-J11显微镜(日本奥林巴斯公司);RM2015切片机(德国莱卡公司)。
取白子菜干品1 kg,加10倍量的水,浸泡1 h后回流提取1.5 h,趁热过滤,药渣加8倍量水回流提取1.0 h,趁热过滤,将两次滤液混合并摇匀,浓缩药液,各制成相当生药2 g/mL的浸膏,置4 ℃冰箱备用。
取 90 只SPF级KM小鼠适应性饲养3 d,随机取出 10 只作为正常对照组,其余小鼠随机平均分为T2DM组、(T2DM+AKI)组、(白子菜高、低剂量+T2DM)组、(白子菜高、低剂量+T2DM+AKI)组、(二甲双胍+T2DM)组和(二甲双胍+T2DM+AKI)组。小鼠喂食高糖高脂饲料结合一次性腹腔注射 100 mg/kg 的链脲佐菌素复制T2DM模型,T2DM小鼠腹腔注射 LPS(10 mg/kg)复制(T2DM+AKI)模型。给药组小鼠腹腔注射 LPS前 7 d 开始,用白子菜水煎液灌胃,1次/d,持续 15 d。除正常对照组外,其余各组小鼠全程喂养高脂饲料直至实验结束。
观察各组小鼠饮食及大小便、活动状态、精神状况等。
在小鼠第15d末次给药后,禁食不禁水12 h,尾尖取血,利用罗氏血糖测试仪测定血糖值。
血液样品在室温放置 2 h 后,于4 ℃ 条件3 000 r·min-1离心 10 min,收集血清按试剂盒说明书测定BUN、Scr的含量。
取肾组织,放入匀浆管,称量后加入9倍量预冷的生理盐水进行匀浆,匀浆后于4 ℃ 条件3 000 r·min-1离心10 min,并提取上清液按ELISA试剂盒说明书操作检测TNF-α、IL-6和IL-10含量。
取肾组织,用预冷生理盐水进行清洗并称量,浸于10%甲醛溶液24 h,脱水石蜡包埋,60 ℃条件下固定1 h,并以二甲苯溶液处理10 min,切片依次以梯度乙醇溶液处理,再以 PBS 洗涤3次,每次5 min。进一步以苏木素染液染色10 min,并用1%盐酸酒精分化;以促蓝液反蓝5 s后加伊红染液染色3 min,再依次用 80%乙醇、95%乙醇、无水乙醇、二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ脱水,晾干后以中性树胶封片,光镜下观察肾组织形态学改变。
正常对照组小鼠反应灵敏,活动正常,体毛光泽,饮食饮水正常,大便颗粒状,尿淡黄色,垫料干燥,体质量增加。T2DM 组小鼠反应迟钝,倦怠蜷卧或烦躁易怒,体毛枯燥,饮食饮水增多,常有腹泻,尿多,垫料潮湿,体质量减少,(T2DM+AKI)组小鼠上述异常表现更明显。与T2DM组、(T2DM+AKI)组比较,白子菜各剂量组小鼠各项表现趋于正常。
结果如表 1所示,与正常对照组比较,T2DM组、(T2DM+AKI)组小鼠空腹血糖含量显著升高,且(T2DM+AKI)组较T2DM组升高明显。与T2DM组、(T2DM+AKI)组比较,白子菜各剂量组小鼠空腹血糖含量均显著降低。
表1 对小鼠空腹血糖水平的影响
结果如表 2 所示,与正常对照组比较,T2DM组、(T2DM+AKI)组小鼠血清BUN、Scr 含量均显著增加,且(T2DM+AKI)组较T2DM组增加明显。与T2DM组、(T2DM+AKI)组比较,白子菜各剂量组小鼠血清BUN、Scr含量均显著减少。
表2 对小鼠BUN、Scr含量的影响
结果如表 3 所示,与正常对照组比较,T2DM组、(T2DM+AKI)组小鼠肾组织TNF-α、IL-6含量明显增加,而IL-10含量明显减少,且(T2DM+AKI)组较T2DM组增加或减少明显。与T2DM组、(T2DM+AKI)组比较,白子菜各剂量组小鼠肾组织TNF-α、IL-6含量明显减少,而IL-10含量明显增加。
表3 对小鼠肾组织TNF-α,IL-6和IL-10含量的影响
结果如图 1 所示,正常对照组小鼠肾组织结构正常,肾小管结构清晰,肾小球数目较多且大小均匀,形态正常,未见炎性细胞。T2DM组、(T2DM+AKI)组小鼠肾小管明显扩张,肾小球萎缩变形,排列不均匀,数目与正常对照组比较明显减少,可见严重的肾脏损伤,且(T2DM+AKI)组较T2DM组严重。同T2DM组、(T2DM+AKI)组比较,白子菜各剂量组小鼠肾小球结构较清晰,数目也增多,大小形态基本恢复正常,肾小球萎缩现象得到一定程度的缓解。
图1 各组肾脏病理组织(HE,×200)
研究表明,BUN 和 Scr含量增加是AKI的重要标志[23],而DM或 T2DM和高尿酸血症之间相互影响,即通过降低血尿酸可改善血糖水平[24-25]。但是,目前对(T2DM+AKI)动物模型的研究甚少,本研究通过链脲佐菌素合并腹腔注射LPS的方法复制(T2DM+AKI)小鼠模型。结果表明,与正常对照组比较,T2DM组、(T2DM+AKI)组小鼠肾小球萎缩变形,数目明显减少,可见严重的肾损伤,且(T2DM+AKI)组较T2DM组严重;空腹血糖、血清BUN和Scr含量均明显增加,且(T2DM+AKI)组较T2DM组增加更明显,说明(T2DM+AKI)小鼠模型复制成功,且高尿酸与高血糖对(T2DM+AKI)有一定的协同作用。与T2DM组、(T2DM+AKI)组比较,白子菜组小鼠肾小球结构清晰,数目明显增多,大小形态恢复正常,肾小球萎缩现象得到一定程度的缓解;空腹血糖、血清BUN和Scr含量明显降低,说明白子菜能够改善(T2DM+AKI)的异常。
还有研究证实,炎症反应是导致 AKI 的重要因素,如 AKI 患者血清TNF-α、IL-1β 及 IL-6 均显著升高[26]。其中,TNF-α介导免疫调节、炎症、生长调节等多方面的效应,可作为诊断早期DN的指标[27];IL-6 利用自分泌或旁分泌的方式和位于肾小球系膜细胞上的受体相结合,促使细胞外基质的生成及肾小球系膜的增生,引起肾小球硬化症,进而导致DN的发生、发展[28]。还有研究发现,小鼠肾缺血再灌注模型促炎因子单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等增多,而抗炎因子血红素氧化酶-1(HO-1)、白细胞介素-10(IL-10)等减少,导致促炎与抗炎反应间的不平衡,从而引发肾损伤[29]。本实验研究表明,(T2DM+AKI)小鼠肾组织促炎因子TNF-α、IL-6含量明显增加,而抗炎因子IL-10含量明显减少;给予白子菜干预后,小鼠肾组织促炎因子 TNF-α、IL-6含量明显减少,而抗炎因子IL-10含量明显增加。
综上所述,白子菜对(T2DM+AKI)具有保护作用,表现为同时降低空腹血糖、血清BUN和Scr含量,而其机制可能与抑制炎症反应有关。虽然本研究具体机制尚未清晰,但仍具有一定研究开发前景,对未来进一步研究提供思路。
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