绞股蓝饮片的质量标准研究

时间：2024-06-19

李妮励，梁永娟，黄千禧，黎欣，林青华，2*

(1.广西中医药大学药学院，广西南宁 530200；2.广西中医药大学广西壮瑶药工程技术研究中心，广西南宁 530200)

绞股蓝又名七叶胆，为葫芦科植物绞股蓝Gynostemmapentaphyllum(Thunb.) Makino的干燥全草[1]，因绞股蓝部分皂苷结构与人参皂苷相似，因而又被称作“南方人参”[2]。其性寒，味苦、微甘，归脾、肺、肾经，具有清热解毒、止咳祛痰、益气养阴、延缓衰老的功效[3-4]，是广西地区壮医、瑶医的习用品种。现代研究[5-7]表明，绞股蓝含有皂苷、黄酮、多糖、氨基酸等多种化学成分，具有降血脂、降血糖、抗氧化、抗癌、抗炎、调节免疫力等多种药理活性，临床常用于治疗糖尿病、慢性支气管炎、肾盂肾炎等多种疾病[8-10]。

绞股蓝始载于《救荒本草》[11]，现被广西、天津、上海、浙江、安徽、福建、江西、湖南、四川等地的中药饮片炮制规范收载[12]。但绞股蓝在《广西壮族自治区中药饮片炮制规范》(2007年版)及《广西壮族自治区瑶药材质量标准：第一卷》中仅有性状特征和茎横切面显微特征的描述，再无其他质量要求。这不利于绞股蓝饮片的质量控制与评价，如葡萄科植物乌蔹莓Cayratiajaponica(Thunb.) Gagnep的外观就与其较为相似，肉眼难以区分，极易混淆[13]，因此对绞股蓝饮片的质量标准开展研究很有必要，可满足其质量控制与评价的要求。故本研究根据2020版《中华人民共和国药典：四部》[14](下文称《药典》)的相关规定，对10批不同产地的绞股蓝饮片进行定性鉴别(性状、粉末、薄层色谱)与定量研究(水分、灰分、浸出物、含量测定)，以期建立绞股蓝饮片的质量标准，为其质量控制与评价提供依据。

1 材料与仪器

1.1 材料

10批不同产地的绞股蓝药材经广西中医药大学药用植物教研室朱意麟老师鉴定为葫芦科植物绞股蓝Gynostemmapentaphyllum(Thunb.) Makino的干燥全草，见表1。绞股蓝皂苷XLIX对照品(批号MUST-19112910，纯度>98.0%)、人参皂苷Rb1对照品(批号MUST-19060116，纯度>98.0%)均购于成都曼斯特生物科技有限公司，芦丁对照品(批号：190328，纯度>98.0%)、槲皮素对照品(批号：190331，纯度>98.0%)均购于上海融禾医药科技有限公司。

表1 10批绞股蓝药材编号与来源

1.2 仪器

LC-2030 Plus高效液相色谱仪(日本岛津公司)，Ultimate©XB-C18色谱柱(月旭科技(上海)股份有限公司)，色谱乙腈(赛默飞世尔科技(中国)有限公司)，Direct-Q5UV超纯水仪一体机(广西南宁博美生物科技有限公司)，KQ-500E超声波清洗仪(昆山市超声仪器有限公司)，硅胶G板(青岛海洋化工有限公司)，磷酸、甲醇为分析纯。

2 方法

2.1 性状鉴别

10批绞股蓝药材喷淋适量清水软化，切成长度为1 cm的段，干燥；按《药典》通则“0212药材和饮片检定方法”对饮片形状、大小、颜色、表面、质地、断面及气味进行描述。

2.2 显微鉴别

2.3 薄层色谱鉴别

取绞股蓝饮片粉末(过五号筛)2 g，加80%的甲醇40 mL，超声处理(功率250 W，频率33 kHz)30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加80%甲醇2 mL溶解，即得供试品溶液；取芦丁和槲皮素对照品各1 mg，分别加80%的甲醇制成每1 mL含0.1 mg的芦丁对照品溶液及槲皮素对照品溶液，备用。

按照《药典》通则“0502薄层色谱法”规定，吸取对照品溶液、供试品溶液各5 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-甲酸-水(8∶1∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷3% AlCl3乙醇溶液，在105 ℃加热至斑点显色清晰。置365 nm紫外灯下观察。

2.4 水分、灰分和浸出物的测定

按照《药典》通则“0832水分测定法(烘干法)”“2302灰分测定法”“2201浸出物测定法(水溶性浸出物，热浸法)”的要求，分别对绞股蓝饮片的水分、总灰分、酸不溶性灰分及水溶性浸出物进行测定。

2.5 含量测定

2.5.1 对照品溶液的制备取绞股蓝皂苷XLIX、人参皂苷Rb1适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含绞股蓝皂苷XLIX 0.131 mg及人参皂苷Rb10.099 mg的混合溶液，即得。

2.5.2 供试品溶液的制备取绞股蓝饮片粉末(过五号筛)约2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加甲醇20 mL，密塞，称定重量，放置30 min，时时振摇；超声处理(功率250 W，频率33 kHz)30 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足损失重量，摇匀，滤过，精密移取续滤液10 mL，置25 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.5.3 色谱条件 Ultimate©XB-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；乙腈(A)-0.2%磷酸水溶液(B)为流动相，梯度洗脱(0～5 min，20% A；5～15 min，20%～40% A；15～20 min，40% A，20～21 min，40%～20% A；21～35 min，20% A)；流速1 mL/min；进样量10 μL；柱温30 ℃；检测波203 nm。

2.5.4 方法学考察线性关系考察：精密吸取0.125 mL、0.50 mL、3 mL、4 mL、6 mL “2.5.1”项下的对照品溶液分别置10 mL容量瓶中，甲醇定容，摇匀，滤过，取续滤液置液相小瓶中，按“2.5.3”项下色谱条件依次吸取10 μL进样分析，并以峰面积(A)为纵坐标，浓度(μg/mL)为横坐标，分别计算绞股蓝皂苷XLIX、人参皂苷Rb1的回归方程及线性范围。

精密度考察：取“2.5.4”项下的同一浓度对照品溶液，按“2.5.3”项下色谱条件连续进样6次，按峰面积计算绞股蓝皂苷XLIX、人参皂苷Rb1的相对准偏差(RSD)。

鲁迅“从这搏斗的危险、紧张、艰难中感到活跃的生命力、感到生活的充实，产生唯有斗士才能体验的幸福感。”[4]160他认为“死者倘不埋在活人的心中，那就真真死掉了”。[7]280“唯独革命家，无论他生或死，都能给大家以幸福。”[9]410正如冯雪峰在《鲁迅回忆》中说“现实战斗的意志、需要和目的，决定着和统一着鲁迅先生的全部思想”。真诚、抗争的人生态度，斗士的生存方式和价值取向，使鲁迅的散文体现出冷峻刚毅的风格。

重复性试验：取JGL-20190623号绞股蓝样品按“2.5.2”项下方法，平行制备6份供试品，按“2.5.3”项下色谱条件进样，并按峰面积计算绞股蓝皂苷XLIX、人参皂苷Rb1的RSD值。

稳定性试验：取JGL-20190623号绞股蓝样品按“2.5.2”项下方法制备供试品溶液，于0、2、4、8、12、24 h按“2.5.3”项下色谱条件进样，并按峰面积计算绞股蓝皂苷XLIX、人参皂苷Rb1的RSD值。

加样回收试验：取已知含量的绞股蓝样品(绞股蓝皂苷XLIX为1.02%、人参皂苷Rb1为0.31%)按“2.5.2”项下方法，平行制备6份供试品，分别向其加入定量的绞股蓝皂苷XLIX、人参皂苷Rb1对照品，按“2.5.3”项下色谱方法进样，并计算绞股蓝皂苷XLIX、人参皂苷Rb1的回收率及RSD值。

样品含量测定：取各批绞股蓝饮片，分别按“2.5.2”项下方法制备供试品溶液，根据“2.5.3”项下色谱条件进样，并分别计算各样品中绞股蓝皂苷XLIX及人参皂苷Rb1的含量。

3 结果

3.1 性状鉴别

绞股蓝饮片呈不规则段状。茎类圆柱形，具细纵棱，直径1～2 mm，表面黄绿色或淡绿色，被短柔毛或近无毛，质韧，不易折断，断面不平坦，髓部微白；卷须二叉或不分叉，侧生于叶柄基部；叶互生，薄纸质或膜质，皱缩，易碎落，完整叶片润湿后展开呈五叶或七叶鸟足状，小叶呈卵状长圆形或长圆状披针形，中央小叶常3～12 cm，宽1.5～4 cm，叶端渐尖，叶基楔形，叶缘锯齿状；圆锥花序纤细；花细小，常脱落；果实球形，无毛，直径约5 mm，成熟时呈黑色；种子宽卵形，两面具乳状凸起。气微，味苦微甘，嚼之有纤维性。见图1。

图1 绞股蓝饮片(A)及其复叶与果实[15](B)

3.2 显微鉴别

绞股蓝饮片粉末为浅绿色。纤维众多，浅绿色，长约100～400 μm，常单个散在或聚集成束，呈长梭形，晶鞘纤维易观察，方晶明显，散布在纤维中央或两边。草酸钙簇晶散在细胞中，形似荷花，草酸钙针晶成束存在。石细胞类菱形，呈棕黄色，三面增厚，层纹清晰，孔沟明显，散在或成团，有些依附于纤维上。少量表皮可见不定式气孔，呈开放或闭合状态。导管众多，有具缘纹孔导管及螺旋导管。腺毛、非腺毛随处可见，腺毛的节与节间明显，形似扫帚，腺头多破碎不完整；非腺毛呈圆锥形，较细长，一般为3～14个细胞构成，长120～360 nm。晶体散落在基质中。淀粉粒较多，呈肾型、人字形、圆形或椭圆形，多为单粒或复粒。还有少量多糖团块，偶见微量油滴。见图2。

注：1.草酸钙簇晶；2.草酸钙针晶；3.石细胞；4.气孔；5.具缘纹孔导管；6.晶鞘纤维；7.纤维；8.非腺毛；9.腺毛；10.晶体；11.油滴；12.淀粉粒；13.多糖团块。

3.3 薄层色谱鉴别

薄层色谱鉴别见图3。图3结果表明，槲皮素对照品、芦丁对照品分别与各供试品在硅胶G板的相应位置上，显浅绿色荧光斑点，但不同供试品间荧光斑点大小有差异，说明各样品中槲皮素、芦丁的含量不同。

注：1～5、8～12为绞股蓝供试品；6.槲皮素对照品；7.芦丁对照品。

3.4 水分、灰分和浸出物的测定

绞股蓝饮片的水分、灰分及水溶性浸出物的测定结果见表2。由表2结果可知，绞股蓝饮片的水分含量为9.64%～11.19%，总灰分含量为8.95%～12.84%，酸不溶性灰分含量为0.17%～1.51%，水溶性浸出物的含量为22.21%～32.26%。根据上限值上浮动20%的原则，拟定绞股蓝饮片水分、总灰分和酸不溶性灰分的限量值分别不得超过13.0%、15.0%、2.0%；根据水溶性浸出物下限值的80%拟定绞股蓝饮片中水溶性浸出物的含量不得低于18.0%。

表2 绞股蓝饮片中水分、总灰分、酸不溶性灰分与水溶性浸出物含量

3.5 含量测定

绞股蓝皂苷XLIX、人参皂苷Rb1混合对照品及绞股蓝饮片供试品的高效液相色谱见图4。

线性关系考察结果表明，绞股蓝皂苷XLIX及人参皂苷Rb1的回归方程分别为YXLIX=1 620 741X+ 12 436(r=0.999 6)和YRb1=1 097 240X+ 1 431(r=0.999 4)，说明绞股蓝皂苷XLIX、人参皂苷Rb1分别在1.64～78.60 μg/mL、1.24～59.40 μg/mL的浓度范围内线性关系良好。精密度考察结果表明，绞股蓝皂苷XLIX、人参皂苷Rb1的RSD值分别为1.64%、1.97%，说明仪器精密度良好。重复性试验结果表明，绞股蓝皂苷XLIX、人参皂苷Rb1的平均含量分别为1.02%、0.31%，其RSD值分别为1.48%、1.73%，说明该方法重复性良好。稳定性试验结果表明，绞股蓝皂苷XLIX、人参皂苷Rb1的RSD值分别为1.97%、1.84%，说明供试品溶液在24 h内稳定性良好。由加样回收试验结果可知，绞股蓝皂苷XLIX、人参皂苷Rb1加样回收率的平均值分别为100.16%、100.21%，其RSD值分别为1.40%、0.95%，见表3。方法学考察结果表明，选定的高效液相色谱条件可靠、稳定，可用于绞股蓝饮片中绞股蓝皂苷XLIX、人参皂苷Rb1的含量测定。

注：1.人参皂苷Rb1；2.绞股蓝皂苷XLIX。

表3 绞股蓝皂苷XLIX、人参皂苷Rb1加样回收试验结果

10批绞股蓝饮片中绞股蓝皂苷XLIX、人参皂苷Rb1的含量见表4。由表4结果可知，10批绞股蓝饮片中绞股蓝皂苷XLIX、人参皂苷Rb1的含量分别为0.12%～0.98%及0.02%～0.30%。按照含量下限值的80%制订其限量标准，拟定绞股蓝饮片中绞股蓝皂苷XLIX、人参皂苷Rb1的含量分别不得低于0.10%、0.01%。

表4 10批绞股蓝饮片中绞股蓝皂苷XLIX、人参皂苷Rb1含量

4 讨论

4.1 薄层色谱法

本实验在薄层色谱鉴别过程中，分别考察了溶剂(甲醇、80%甲醇)和展开剂(乙酸乙酯-甲醇-水-甲酸、乙酸乙酯-甲醇-水、三氯甲烷-甲醇-水、正丁醇-乙酸乙酯-水、三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水)对展开效果的影响，结果发现当采用甲醇为溶剂制备的样品在展开过程中会出现拖尾现象，而采用80%甲醇制备样品则无拖尾现象，故采用80%的甲醇为溶剂制备样品；在考察的众多展开剂中，只有以乙酸乙酯-甲酸-水(8∶1∶1)为展开剂时才能使芦丁、槲皮素的斑点清晰，故选择乙酸乙酯-甲酸-水(8∶1∶1)作为展开剂。

4.2 高效液相色谱法

本实验在高效液相色谱条件的选择过程中，分别考察了流动相(乙腈-纯水、乙腈-0.2%磷酸水)、波长(203 nm、210 nm)、柱温(30 ℃、40 ℃)、提取方法(超声法、回流法)、提取溶剂(甲醇、80%甲醇)等因素对绞股蓝皂苷XLIX、人参皂苷Rb1分离度及峰面积的影响，结果发现绞股蓝样品的最佳提取方式为甲醇超声提取，流动相以乙腈-0.2%磷酸水梯度洗脱为宜，最佳波长及柱温分别为203 nm、30 ℃。