基于网络药理学与分子对接技术的化湿败毒颗粒治疗新型冠状病毒肺炎作用机制及活性成分筛选研究

王恩龙，何黎黎，李 婧，2*

(1.西南民族大学 药学院，四川 成都 610041；2.四川大学 生物治疗国家重点实验室，四川成都 610041)

新型冠状病毒肺炎(Corona virus disease 2019，COVID-19)是由新型冠状病毒(SARS-CoV-2)所引起的一种急性感染性肺炎[1]，轻症患者或初期患者主要表现为呼吸道症状，包括咳嗽、发热、气促以及呼吸困难等；后期或重症患者可导致肺炎、急性呼吸综合征、肾衰竭，甚至死亡[2]。然而，目前针对COVID-19尚无特效的化学药物[3]，因此，从中药中筛选针对抗COVID-19的中药复方及活性化合物十分迫切。

化湿败毒颗粒是国家药品监督管理局批复的首个治疗新冠肺炎的中药临床批件，也是由此次疫病理论和临床结合创新所得。本方由14味中药组成，包括生麻黄、生石膏、杏仁、赤芍、葶苈子、法半夏、甘草、茯苓、藿香、草果、苍术、厚朴、生黄芪、生大黄。中国医学院实验动物研究所、中国中医科学院实验研究表明，化湿败毒颗粒在动物及临床应用中均显示出良好效果。然而化湿败毒颗粒药味多、成分复杂，抗COVID-19作用关键活性成分及作用机制尚不清楚。中药具有多成分、多靶点、多途径的特点，而网络药理学是通过构建“疾病-基因-靶点-药物”网络关系，从整体上预测药物作用靶点并分析作用机制的方法[4]，是目前生物信息学研究中药的常用方法，采用网络药理学方法研究化湿败毒颗粒抗COVID-19作用机制与中药多成分多靶点的研究思路相符。分子对接技术是目前一种广泛应用的能快速准确地预测蛋白-配体复合物结合构象和亲和力并辅助筛选活性成分的重要研究技术[5]。近期，SARS-CoV-2的主要靶蛋白3CL水解酶蛋白(3CLpro)、宿主细胞表面的血管紧张素转化酶2(ACE2)及RNA 依赖性RNA聚合酶(RdRp)相继被解析，为分子对接筛选抗COVID-19活性中药成分提供了基础[6]。本研究拟采用网络药理学结合分子对接技术，预测化湿败毒颗粒治疗COVID-19作用机理，筛选其潜在活性成分，以期为后续实验研究开发以及临床应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 化湿败毒颗粒活性成分及作用靶点的筛选

通过中药系统药理学分析平台(TCMSP，http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)数据库挖掘化湿败毒颗粒中14种药材的化学成分。以口服生物利用度(Oral bioavailability，OB)≥30%以及药物相似性(Drug-likeness，DL)≥0.18为参考评估筛选候选化合物，建立“化湿败毒颗粒活性成分数据库”。通过TCMSP检索以上活性成分的潜在作用靶点并整合，映射到Uniprot数据库(http：//www.uniprot.org/)统一为基因名，建立“化合物靶点数据库”。

1.2 疾病相关靶点的筛选

在OMIM数据库(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/omim) 和GeneCards数据库(https：//www.genecards.org/) 中检索与病毒及肺炎相关的基因，将2种方法得到的靶蛋白整合并与“1.1”中得到的化合物靶点采用R语言取交集，作为化湿败毒颗粒潜在的作用靶蛋白。

1.3 化湿败毒颗粒成分-作用靶点网络的构建与分析

Cytoscape是一款能直观分析药物治疗疾病的作用机制的可视化软件[7]。将化湿败毒颗粒的潜在活性成分及作用靶点通过Cytoscape(Version 3.7.1)建立“活性成分-靶点-疾病”网络。网络中节点(node)表示化合物及靶点，节点之间的互作用关系由边(edge) 表示。节点的重要性可以通过自由度(Degree)及介数(Betweenness centrality)来评估。节点的Degree表示与节点连接的边的数量，Degree越大的节点在网络中越重要。使用Network Analyzer分析网络拓扑参数。

1.4 生物过程(GO)与通路分析(KEGG)

生物学信息注释(DAVID，https：//david.ncifcrf.gov/)数据库可以进行基因或蛋白显著富集的生物学注释。将化湿败毒颗粒潜在的作用靶基因ID导入DAVID数据库，对化湿败毒颗粒作用靶基因可能存在的生物过程(Biological process，BP)、细胞组分(Cellular component，CC)及分子功能(Molecular function，MF)进行生物过程GO富集分析(P<0.05)以及KEGG通路富集分析(P<0.05)，根据P值大小绘制气泡图及柱状图。

1.5 分子对接分析关键活性成分

从RSCB 蛋白质结构数据库(PDB)中下载SARS-CoV-2的3CLpro(PDB ID：6LU7)、ACE2(PDB ID：1R42)及RdRp(PDB ID：6M71)蛋白三维结构用于分子对接研究。采用Auto Dock Tools 1.5.6 软件删除受体蛋白复合物中水分子，分离配体和受体，添加非极性氢，计算Gasteiger电荷，保存为pdbqt文件。从Pubchem下载“1.3”项中Degree较高的小分子化合物3D坐标文件进行预处理后保存为pdbqt格式，作为对接配体。分别以3CLpro、ACE2及RdRp蛋白为受体，将小分子化合物作为配体，根据靶蛋白复合物中配体的坐标或文献报读的活性位点确定分子对接的位置，根据每个受体蛋白活性口袋设置Gridbox坐标及大小，采用Auto Dock Vina进行分子对接，对对接结果进行分析处理，筛选化湿败毒颗粒潜在活性成分。

2 结果与分析

2.1 化湿败毒颗粒活性成分筛选及靶点获取

通过TCMSP 数据库，以OB≥30%，DL≥0.18为标准，筛选得到的化湿败毒颗粒活性成分共186个，其中生麻黄18个、杏仁12个、赤芍21个、葶苈子7个、甘草48个、法半夏10个、茯苓14个、草果2个、藿香11个、苍术8个、生黄芪18个、厚朴2个、生大黄15个。化湿败毒颗粒中部分活性成分信息见表1。

表1 化湿败毒颗粒中部分活性成分信息

2.2 化湿败毒颗粒潜在作用靶点预测

在TCMSP数据库检索“2.1”项中筛选得到的186种化合物的作用靶点，去除重复靶点后与在OMIM及GeneCards数据库检索到的与疾病相关的基因取交集，得到化湿败毒颗粒潜在作用靶蛋白共237个。

2.3 化湿败毒颗粒“活性成分-作用靶点”网络构建

将化湿败毒颗粒活性成分及作用靶点的信息导入到Cytoscape软件建立“活性成分-作用靶点”网络，见图1。由图1可见，“化合物-靶点”网络中有123个化合物及相应的靶点237个，共包含360个节点及2 808条边。拓扑分析显示化合物的平均Degree为7.8，说明每个活性成分可作用于多个靶点，化湿败毒颗粒作用具有多成分、多靶点特性。节点的Degree越大潜在活性越大，部分活性化合物Degree见表1，可见Degree较高化合物有Quercetin、Kaempferol、Luteolin、Wogonin、7-O-methylisomucronulatol、Naringenin、Baicalein、Beta-sitosterol等(Degree≥26)，是化湿败毒颗粒发挥作用重要的潜在活性化合物。PTGS2、PTGS1、NCOA2、ESR1、AR、PPARG、NOS2、PRSS1、SCN5A等靶基因的Degree均大于40，是化湿败毒颗粒作用的重要潜在靶基因。

2.4 活性靶点生物学功能GO及KEGG通路富集分析

将“2.2”项中得到的化湿败毒颗粒237个潜在靶基因ID导入DAVID数据库，对化湿败毒颗粒作用靶点可能存在的生物过程BP、细胞组分CC及分子功能MF进行生物过程GO富集分析(P<0.05)，分析得到GO条目共1 147个(P<0.05)，其中包括生物过程(BP)961个，分子功能(MF)110个，以及细胞组成(CC)76个，每种排名前10的条目见图2。KEGG通路富集到170条信号通路(P<0.05)，排名前20的通路见图3。由图可见化湿败毒颗粒作用涉及AGE-RAGE、IL-17、TNF、C-type lectin receptor、HIF-1等信号通路。

注：红色表示化湿败毒颗粒活性成分，蓝色表示靶点蛋白，边代表相互关系。

图2 化湿败毒颗粒潜在作用靶点GO基因功能分析

图3 化湿败毒颗粒潜在作用靶点KEGG通路富集分析

2.5 化湿败毒颗粒抗2019-nCoV活性成分分子对接

以Degree排名前15的重要活性成分(Degree≥22)作为配体，分别以SARS-CoV-2病毒 3CLpro、ACE2及RdRp为受体进行分子对接。选取打分最高的构象作为对接构象，选取结合能较低且构象较好的结果作为分子对接结果，选取作用明确的几种3CLpro、ACE2及RdRp抑制剂作为对照。化湿败毒颗粒重要活性成分分子对接结果见表2，由表2可见，与3CLpro亲和力较好的成分有Kaempferol、Baicalein等；与ACE2亲和力较好的成分有Shinpterocarpin、Stigmasterol等；与RdRp亲和力较好的成分有Beta-sitosterol、Shinpterocarpin等，这些成分可能是抗COVID-19的关键活性成分。几种关键活性成分与靶蛋白分子对接图见图4，由图4可见，Kaempferol与3CLpro蛋白在SER-144、LEU-141及GLN-189位形成氢键；Stigmasterol与ACE2蛋白在LYS-562位形成氢键；Shinpterocarpin与RdRp蛋白在THR-246位形成氢键。此外，活性成分与靶蛋白还形成了多个Pi-Cation、Pi-Alkyl等键。这些化学键使受体配体形成较稳定的结合。

图4 SARS-CoV-2三种靶蛋白与化湿败毒颗粒中关键活性成分分子对接模式

表2 化湿败毒颗粒重要化合物及临床治疗药物与3种靶蛋白及ACE2 的结合亲和力

3 讨论

COVID-19属于中医“瘟疫”范畴，具有典型湿毒致病的发病特点，并与运气、气候、地理及人群的易感性有关，涉及三焦、肺、胃、脾，在治疗中应采用群防群治与三因制宜相结合的措施[8]。其中医病因病机是湿、毒、寒、热、燥、虚、瘀，因此组方主要针对病毒的作用机理，化湿辟秽、宣肺通腑、活血解毒。化湿败毒颗粒由多个经典名方化裁而来，传承了中医理论精华。本方选取了宣白承气汤、麻杏石甘汤中的部分药物，能宣肺清泄、疏散上焦；选取了藿香正气散、达原饮中化湿和胃的药物，可斡旋中焦；选取了葶苈大枣泄肺汤药物、桃仁承气汤中部分药物，可通达下焦、活血解毒；选取玉屏风散及黄芪赤风汤部分药物，可扶气补正、调理气血、增强机体抵抗力。本方的动物实验及临床实验也进一步证实，化湿败毒颗粒对COVID-19具有良好的临床疗效和救治前景。

SARS-CoV-2需要 3CL 水解酶(3CLpro)来复制 RNA，是病毒的一个关键蛋白质，若化合物与 3CLpro结合可大概率阻断病毒复制，抑制病毒多蛋白裂解并防止传播，为抗病毒药物研发指明方向，因此本研究在微观层面运用分子对接技术，挖掘化湿败毒颗粒抗新型冠状病毒的特异性及可能性。与3CLpro进行对接，结果提示Kaempferol、Baicalein等成分与3CLpro具有较好的亲和力，可作为SARS-CoV-2 3CLpro潜在抑制剂。

已有研究表明，新型冠状病毒感染人体的关键在于SARS-CoV-2表面的S蛋白(刺突糖蛋白，Spike glyco-protein，简称S蛋白) 识别人类宿主的ACE2蛋白从而进入细胞，尤其是S蛋白结构域的细胞受体结合区(Receptor binding domain，RBD)直接参与宿主受体的识别与人体ACE2蛋白的结合，即病毒通过其表面S蛋白与ACE2结合从而侵入人体[9]，目前，S蛋白和 ACE2蛋白已被确定为潜在的临床试验疫苗和治疗靶点，其蛋白晶体结构已经成功解析，这就为通过电脑虚拟筛选针对这2种蛋白的抗病毒药物提供了可能。清肺达原颗粒中有52基因为ACE2的共表达基因。本研究选取化湿败毒颗粒中的化合物与SARS-CoV-2-S-RBD-ACE2进行分子对接，研究发现Stigmasterol、Shinpterocarpin等成分与ACE2具有较好的亲和力，可作为SARS-CoV-2 ACE2潜在抑制剂。

作为RNA 病毒，病毒自身编码的RNA依赖性RNA聚合酶(RdRp)对病毒的RNA 复制起关键作用，RdRp 抑制剂可作为抗RNA 病毒的广谱抗病毒药物。RdRp蛋白结构中有一个大而深的凹槽结构区作为RNA合成的活性中心。以RdRp作为靶点的药物也是目前研发的热点，Ribavirin及Remdesivir是目前正处于临床研究的COVID-19病毒RdRp抑制剂。近期“清华大学-上海科技大学抗新冠病毒联合攻关团队”在全世界率先成功解析新型冠状病毒“RdRp-nsp7-nsp8复合物”近原子分辨率的三维空间结构，为本研究分子对接寻找化湿败毒颗粒中RdRp抑制成分提供了蛋白基础。分子对接结果提示Beta-sitosterol、Shinp-terocarpin等成分与RdRp具有较好的亲和力，可作为SARS-CoV-2 RdRp潜在抑制剂。

本研究采用网络药理学对化湿败毒颗粒抗COVID-19的作用机理进行了研究，并对化湿败毒颗粒抗COVID-19具有较高度数的关键化学成分进行了筛选，并进一步采用分子对接的方式，以目前作用明确且已解析可得的3种蛋白3CLpro、ACE2及RdRp蛋白为靶蛋白，对化湿败毒颗粒中Degree较高的重要活性成分进行了分子对接，筛选出关键活性成分。对接结果显示，化湿败毒颗粒中Degree较高的Quercetin、Kaempferol、Luteolin、Wogonin、7-O-methylisomucronulatol、Naringenin、Baicalein、Beta-sitosterol、Stigmasterol、Formononetin等成分与靶蛋白均有一定亲和力。Quercetin(槲皮素)是一种天然黄酮类化合物，可激活或抑制许多蛋白质的活性，槲皮素可抑制流感病毒及HCV病毒[10]。Kaempferol(山奈酚)属于黄酮类化合物，山奈酚可以抑制流感、HIV等病毒[11-12]。Luteolin(木犀草素)是一种天然黄酮类化合物，可以通过干扰外壳蛋白I复合物的表达在体外抑制甲型流感病毒[13]，还可以通过抑制前蛋白转化酶抑制登革病毒复制[14]。Baicalein(黄芩素)是黄芩中含量较高的黄酮类化合物，黄芩素对流感病毒有抑制作用[16]，还具有抗登革病毒活性[15]。

化湿败毒颗粒作为国家药品监督管理局首个批准用于临床的中药复方，其作用机制和活性成分尚无研究，因此我们从两方面探讨化湿败毒颗粒对抗COVID-19疾病的潜在机制及活性成分。一方面运用网络药理学明确活性成分及其靶蛋白，构建化湿败毒方的“成分-靶点-通路”多层次互作网络；另一方面通过分子对接技术分析化湿败毒方的活性化合物抗SARS-CoV-2的特异性及可能性，为后续进行体内外实验提供科学假设及理论依据，更好地发挥中医药抗击疫情的防治效果。