HPLC法测定麦冬安神合剂中斯皮诺素含量

卢文华，邓光明，杨凤全，李 希，王 琳，王 玉*

(1.三台县中医院，四川 绵阳 621100；2.四川省中医药科学院 中医研究所，四川 成都 610031)

麦冬安神合剂可养阴、益气、安神，用于治疗气阴亏虚、心肾失交所致的失眠，疗效显著。麦冬安神合剂由麦冬、酸枣仁、太子参、茯神木等7味中药组成，其中，君药麦冬养阴清热，含有多种甾体皂甙、胡萝卜素等成分，具有抗疲劳、清除自由基、镇静催眠、抗心肌缺血、抗心律失常等作用[1-7]。炒酸枣仁、太子参、茯神木共为臣药，诸药合用可补气安神。炒酸枣仁镇静、催眠作用显著，其有效成分是皂苷类及黄酮类化合物，镇静、催眠作用比安定更持久平稳[8-15]。太子参含有多种人参皂甙，可调节中枢神经系统兴奋过程及抑制过程，还可调节神经功能，恢复由于紧张造成的神经过程紊乱，有明显中枢镇静作用[16-18]。茯神木含有蛋白质、茯苓多糖等有效成分，具有增强生理活性、刺激免疫系统功能恢复、安神健胃的作用[19-20]。在实验中，君药麦冬的多种甾体皂甙含量测定均有干扰，难以反映麦冬安神合剂的质量。因此，采用高效液相色谱法测定臣药炒酸枣仁的有效成分斯皮诺素，可为该制剂质量标准的建立提供科学依据，现报道如下。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Waters e2695型高效液相色谱仪(美国沃特世有限公司)；2489型UV/Vis 检测器(美国沃特世有限公司)；BT-125D型分析天平(赛多利斯科学仪器(北京)有限公司)；YPR-10T型超纯水器(北京英普瑞环保设备有限公司)；AS20500T型超声波清洗器(天津奥特赛恩斯仪器有限公司)。

1.2 材料

斯皮诺素对照品(批号：111869-201704，纯度：97.2%)由中国食品药品检定研究院提供；麦冬安神合剂样品(由三台县中医院制剂室提供，批号：20200301、20200302、20200303)；乙腈、甲醇、磷酸为色谱纯，水为超纯化水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件考察

2.1.1 色谱柱筛选 参考文献[10-15]，结合化合物性质，斯皮诺素采用以C18为填充剂的反相色谱柱测定。分别考察色谱柱Agilent Zorbax SB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)、Agilent extend-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)、DIKMA Diamonsil-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)、SHIMADZU VP-ODS(4.6 mm×150 mm，5 μm)，结果显示，Agilent Zorbax SB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)保留时间合适、分离度高，选择Agilent Zorbax SB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色谱柱进行试验。

2.1.2 流动相筛选 参考文献[10-15]，本实验分别考察了乙腈-0.1%磷酸、甲醇-0.1%磷酸、乙腈-水、甲醇-水4种流动相组合。结果4种流动相组合色谱图效果无明显差异，分离度、对称性均良好，其中甲醇-水系统有一紧挨的相邻峰干扰。结合实际操作便利性，拟定乙腈-水为流动相。

2.1.3 检测波长筛选 参考相关方法，斯皮诺素所示色谱峰光谱吸收曲线图在335 nm处附近均有较强的紫外吸收，335 nm波长下该色谱峰对称性好、响应值较高，拟采用检测波长为335 nm。

2.1.4 柱温与流速筛选 本实验分别考察了常用柱温25、30、35 ℃，常用流速0.8、1.0、1.2 mL/min。结果柱温与流速对色谱图效果影响无明显差异，选择柱温30 ℃，流速1.0 mL/min，在该柱温与流速下，待测色谱峰与邻峰均无干扰，分离度良好，峰对称性良好。

2.1.5 洗脱程序筛选 实验对乙腈-水系统的检测时间及梯度作出优化，结合色谱图效果及检测效率，拟定洗脱程序为0～10 min，12%～19% A；10～16 min，19%～20% A；16～22 min，20%～98% A；22～35 min，98% A；35～40 min，98%～12% A。

2.1.6 色谱条件与系统适应性 色谱柱Agilent Zorbax SB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流动相为乙睛(A)-水(B)，梯度洗脱程序为0～10 min，12%～19% A；10～16 min，19%～20% A；16～22 min，20%～98% A；22～35 min，98%A；35～40 min，98%～12% A；流速为1.0 mL·min-1；柱温为30 ℃；检测波长335 nm，进样量10 μL，理论板数按斯皮诺素峰计算应不低于2 000。

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液制备 精密称取斯皮诺素对照品10.31 mg，置10 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，即得对照品储备溶液。精密吸取对照品储备溶液2 mL，置25 mL容量瓶中，加甲醇至刻度线，摇匀，即得(每1 mL含斯皮诺素80.170 6 μg)。

2.2.2 供试品溶液制备考察 提取方式及溶剂种类筛选：精密吸取本品2 mL，2份，分别置5 mL量瓶中，分别加甲醇、乙醇近刻度线，超声处理1 h，放冷，再加相应溶剂定容，摇匀，经0.45 μm微孔滤膜，取续滤液，即得。精密吸取本品2 mL，2份，分别置5 mL量瓶中，分别加甲醇、乙醇稀释至刻度，摇匀，经0.45 μm微孔滤膜，取续滤液，即得。按上述色谱条件测定，记录峰面积，计算含量。见表1。

表1 不同提取方式及溶剂种类含量

由结果可知，超声、振摇两种提取方式含量无明显差异，拟选振摇。甲醇与乙醇提取的含量差异不大，拟选甲醇提取。

提取溶剂浓度筛选：精密吸取本品2 mL，5份，分别置5 mL量瓶中，分别加甲醇、90%甲醇、80%甲醇、70%甲醇、60%甲醇稀释至刻度，摇匀，经0.45 μm微孔滤膜，取续滤液，即得。按上述色谱条件测定，记录峰面积，计算含量。见表2。

表2 不同提取溶剂浓度含量

由结果可知，不同甲醇浓度提取无明显差异，结合实验操作便利性等因素，拟定提取溶剂浓度为甲醇。

提取溶剂用量筛选：精密吸取本品3、2、2、1、1 mL，各1份，分别置5、5、10、10、25 mL量瓶中，分别加甲醇稀释至刻度，摇匀，经0.45 μm微孔滤膜，取续滤液，即得。按上述色谱条件测定，记录峰面积，计算含量。见表3。

表3 不同提取溶剂用量含量

由结果可知，各溶剂用量下，溶剂比高于2～10 mL溶剂后含量趋于平衡，结合实验成本及操作便利性等因素，拟定2 mL成品所用提取溶剂用量为10 mL。

供试品溶液制备方法：精密量取本品2 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.3 阴性供试溶液制备 按照处方比例，取除酸枣仁外的其他药材，按制备工艺制成缺酸枣仁的阴性样品，按照上述筛选的供试品溶液制备方法，制成阴性供试溶液。

2.3 方法学考察

2.3.1 专属性实验 分别吸取对照品溶液、供试品溶液及阴性供试溶液，按“2.1.6”色谱条件进样，色谱见图1。结果表明，阴性样品无干扰，专属性良好。

注：A对照品色谱；B供试品溶液色谱；C阴性供试溶液。

2.3.2 线性与范围实验 精密吸取“2.2.1”项下对照品溶液(80.170 6 μg/mL，线性1)3、2、1、1、1 mL置5、5、5、10、25 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得系列浓度对照品溶液。按上述色谱条件测定峰面积，结果见表4。以进样浓度(μg/mL)为横坐标(X)、峰面积(Y)为纵坐标，绘制标准曲线并得出线性回归方程。由结果得出回归方程为：Y=22 958X+4 592(r=1)，结果表明，斯皮诺素在80.170 6 μg/mL～3.206 8 μg/mL范围内与峰面积线性关系良好。

表4 线性关系实验结果

2.3.3 精密度实验 取对照品溶液(线性3)，按上述色谱条件，连续进样测定6次，记录色谱图，测定每次进样的斯皮诺素峰面积，结果见表5。由结果可知，斯皮诺素精密度以峰面积计RSD为1.44%，结果表明，该仪器精密度良好。

表5 精密度实验结果

2.3.4 重复性实验 取本品，按供试品溶液制备方法制成供试品溶液，共6份。按上述色谱条件进样测定，记录峰面积，结果见表6。由结果可知，斯皮诺素重复性以峰面积计RSD为0.26%，结果表明，该方法的重复性较好。

表6 重现性实验

2.3.5 稳定性实验 分别取供试品溶液及对照品溶液(线性3)于0、2、4、6、8、10、16、20、24 h，按上述色谱条件进样测定。记录峰面积，结果见表7。由结果可知，供试品及对照品以峰面积计RSD分别为1.74%、0.84%，结果表明，该供试品溶液、对照品溶液在24 h内稳定性良好。

表7 稳定性考察

2.3.6 加样回收率实验 精密吸取本品(按重复性实验计算斯皮诺素含量均值为0.092 9 mg/mL)1 mL，共6份，各精密加入对照品溶液(80.170 6 μg/mL)1 mL，按供试品溶液的制备方法制备加样供试品溶液6份。按上述色谱条件测定，记录峰面积，计算含量，结果见表8。由结果可知，平均回收率为95.37%，RSD=0.67%，表明该方法的加样回收率较好，该方法的准确度良好。

表8 加样回收率实验

2.4 样品含量测定

取3批麦冬安神合剂样品(批号：20200301、20200302、20200303)适量，按供试品溶液制备方法制备供试品溶液。取对照品溶液、供试品溶液，按上述色谱条件进样测定，记录峰面积，计算含量，结果见表9。

表9 样品斯皮诺素含量测定

3 讨论

麦冬安神合剂君药麦冬含有多种甾体皂甙，其中，鲁斯可皂苷元为药效成分，但在预实验中发现，该成分HPLC测定存在阴性干扰等问题，难以作为质量标准测定指标。针对以上问题，优选臣药炒酸枣仁的药效成分斯皮诺素为质量控制指标，其斯皮诺素亦为制备工艺评价指标，质量标准纳入斯皮诺素为含量测定成分，可有效反映本品工艺优劣。炒酸枣仁中斯皮诺素测定，目前已有薄层扫描法、高效液相法等。本实验建立的麦冬安神合剂中斯皮诺素高效液相色谱含量测定方法，经系统方法学研究，具有良好的精密度、准确度及稳定性，简单易操作、可行性强，可用于麦冬安神合剂的质量控制。