基于层次分析法和正交设计法优选盆消灌肠液的提取工艺

蔡妮娜，曹富宁，谢 宁，范源俊，李小金，夏循明

(南宁市中医医院，广西 南宁 530001)

盆消灌肠液的立方根据慢性盆腔炎热、毒、湿、瘀、寒的病机特点，以清热利湿、活血化瘀、养血通络为治疗原则，由丹参、赤芍、三棱、莪术、当归、大血藤、蒲公英、紫花地丁、败酱草、桂枝、马鞭草等多种药材配伍组成。前期临床观察发现，盆消灌肠液具有清热解毒、活血化瘀、止痛之功效，对缓解慢性盆腔炎腹痛、腰骶胀痛、带下量多、经期腹痛、炎性包块及子宫压痛等症状有显著的疗效[1-2]。通过查阅文献[2-7]可知，盆消灌肠液中，各药材有效组分主要为酚酸类、苯丙素类、苷类及黄酮类等，均以一定比例乙醇作为提取溶剂，为使有效成分充分浸出，同时满足本院制剂生产实际条件，本研究采用渗辘提取法，以方中有效成分绿原酸、咖啡酸、芍药苷、阿魏酸、丹酚酸B的含量和干膏得率作为评价指标，采用层次分析法(AHP)确定各指标权重系数，以乙醇浓度、乙醇用量、浸渍时间和渗漉速度为考察因素，结合正交设计实验法优选出最佳渗辘提取工艺，为该制剂的大生产提供理论依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器

1260 InfinityⅡ型HPLC仪，包括四元泵、自动进样器、柱温箱、DAD检测器、色谱工作站 (美国Agilent公司)；十万分之一XS205电子分析天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司)；WH-800超声波清洗机(济宁万和超声电子设备有限公司，功率：800 W，频率：40 kHz)；Best-S30超纯水机(芷昂仪器上海有限公司)。

1.2 材料

丹参、赤芍、三棱、莪术、当归、大血藤、蒲公英、紫花地丁、败酱草、桂枝、马鞭草饮片均购于安徽德昌药业饮片有限公司，经南宁市中医医院制剂室曹富宁副主任中药师鉴定，符合有关规定；绿原酸(中国食品药品检定研究院，批号：110753-200413，纯度：98.70%)、咖啡酸(成都曼思特生物科技有限公司，批号：MUST-20032003，纯度：99.48%)、芍药苷(成都曼思特生物科技有限公司，批号：MUST-19110118，纯度：98.69%)、阿魏酸(成都曼思特生物科技有限公司，批号：MUST-20032928，纯度：98.32%)、丹酚酸B(成都曼思特生物科技有限公司，批号：MUST-19062808，纯度：99.79%)；乙腈为色谱纯，水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 正交试验设计

在预试验基础上，确定乙醇浓度(A)、乙醇用量(B)、浸渍时间(C)和渗漉速度(D)为影响因素，每个因素各取3个水平进行 L9(34)正交试验，正交试验因素水平见表1。

表1 盆消灌肠液正交试验因素水平

2.2 供试品的制备

按处方2倍量称取丹参、赤芍、三棱、莪术、当归、大血藤、蒲公英、紫花地丁、败酱草、桂枝、马鞭草等药材各9份，每份765 g，打成粗粉，按表1因素水平安排渗漉提取实验，各组药液分别用纱布过滤后，最后定容至500 mL，即得。

2.3 干膏率测定

精密吸取供试品25 mL，置于已干燥至恒重的蒸发皿中，水浴蒸干后，移至烘箱中，105 ℃干燥3 h，取出，置干燥器中冷却30 min，迅速取出，精密称定质量，根据公式计算干膏率：干膏率(%)=(所得浸膏净重/药材量)×100%。正交试验干膏率结果，见表4。

2.4 绿原酸、咖啡酸、芍药苷、阿魏酸、丹酚酸B的含量测定

2.4.1 色谱条件 色谱柱：ZORBAX Eclipse XDB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；以乙腈(A)-0.1%磷酸(B)为流动相进行梯度洗脱(0～10 min，10%A，10～40 min，10%→17%A，40～45 min，17%→24%A，45～60 min，24%A)；5种成分的检测波长分别为：0～20 min绿原酸及咖啡酸320 nm，20～30 min芍药苷230 nm，30～40 min阿魏酸320 nm，40～60 min丹酚酸B 280 nm；流速：1.0 mL/min；柱温：35 ℃，进样量：10 μL[8]。

2.4.2 溶液制备 对照品溶液配制：各对照品储备液制备：精密称取绿原酸、咖啡酸、芍药苷、阿魏酸、丹酚酸B对照品适量，加甲醇制成每1 mL含绿原酸0.632 0 mg、咖啡酸0.215 0 mg、芍药苷2.406 mg、阿魏酸0.040 0 mg、丹酚酸B 2.088 mg的溶液。混合对照品溶液：分别精密吸取各对照品储备液适量，加甲醇制成每1 mL含绿原酸0.075 8 mg、咖啡酸0.025 8 mg、芍药苷0.481 2 mg、阿魏酸0.008 0 mg、丹酚酸B 0.250 6 mg的混合对照品溶液。

供试品溶液配制：精密吸取供试品5 mL，置于20 mL容量瓶，加相应溶剂稀释至刻度，摇匀，经0.45 μm微孔滤膜过滤，即得供试品溶液。

阴性对照品溶液配制：取缺少莪术、桂枝、三棱、马鞭草药材的处方量，按“2.2”项下方法，制备阴性对照样品，按“2.4.2”项下供试品溶液的制备方法制备，即得阴性对照品溶液。

2.4.3 系统适应性试验 取“2.4.2”项下对照品溶液、供试品溶液、阴性对照品溶液适量，按“2.4.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱，详见图1。由图1可知，供试品溶液色谱图中，在与对照品色谱相应位置上有相同的色谱峰，且阴性对照品对测定无干扰，说明该方法可行。

注：1.绿原酸；2.咖啡酸；3.芍药苷；4.阿魏酸；5.丹酚酸B。

2.4.4 线性关系考察 分别精密吸取混合对照溶液2、6、8、14、20 μL，注入高效液相色谱仪，测定峰面积。以峰面积为纵坐标、进样量为横坐标，进行线性回归计算，即得绿原酸、咖啡酸、芍药苷、阿魏酸、丹酚酸B的回归方程、相关系数及线性范围。结果表明，5种指标成分在各自含量范围内线性关系良好，见表2。

表2 线性关系考察结果

2.4.5 定量限与检测限考察 精密吸取“2.4.2”项下对照品溶液适量，倍比稀释，按“2.4.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。按信噪比为10∶1、3∶1 分别计算定量限、检测限。结果，绿原酸、咖啡酸、芍药苷、阿魏酸、丹酚酸B定量限分别为25.28、8.600、802.0、11.43、417.6 ng，检测限

分别为7.584、2.580、240.6、3.428、125.3 ng。

2.4.6 精密度考察 精密吸取混合对照品溶液10 μL，按“2.4.1”项下色谱条件连续进样测定6次，以峰面积指标计算RSD(n=6)。结果：绿原酸、咖啡酸、芍药苷、阿魏酸、丹酚酸B峰面积的RSD分别为1.36%、1.30%、0.76%、1.24%、0.56%，表明仪器精密度良好。

2.4.7 重复性考察 取同一供试品适量，按“2.4.2”平行制备6份供试品溶液，按“2.4.1”项下色谱条件，同时测定绿原酸、咖啡酸、芍药苷、阿魏酸、丹酚酸B的峰面积，计算其峰面积RSD分别为0.82%、0.48%、0.56%、0.36%、1.61%(n=6)，表明方法重复性良好。

2.4.8 稳定性考察 取同一供试品溶液，分别于制备后0、2、4、8、16、24 h，按“2.4.1”项下色谱条件进样，测定绿原酸、咖啡酸、芍药苷、阿魏酸、丹酚酸B的峰面积，计算其峰面积RSD分别为1.89%、0.76%、0.43%、0.79%、1.58%(n=6)，表明供试品溶液在24 h内的稳定性良好。

2.4.9 加样回收实验 分别精密吸取已知各成分含量(绿原酸0.398 9 mg/mL、咖啡酸0.055 0 mg/mL、芍药苷1.882 4 mg/mL、阿魏酸0.027 7 mg/mL、丹酚酸B 0.948 0 mg/mL)的供试品溶液0.5 mL，共6份，分别置于5 mL量瓶中，精密加入适量对照品储备液溶液，按“2.4.2”项下方法制备供试品溶液。按“2.4.1”项下色谱条件进样，测定峰面积，计算绿原酸、咖啡酸、芍药苷、阿魏酸、丹酚酸B平均加样回收率分别为97.93%、97.75%、96.86%、97.11%、98.67%，RSD值分别为1.81%、2.63 %、1.84%、2.99%、2.87%，表明方法回收率良好。

2.5 层次分析法(AHP)确定各考察指标的权重系数

2.5.1 构建成对比较的判断优先矩阵 根据盆消灌肠液的处方方解及各成分药理作用强弱，采用1～9标度法对6项指标进行两两比较评判重要性，确定绿原酸、咖啡酸、芍药苷、阿魏酸、丹酚酸B的含量、干膏得率6项指标的优先顺序：绿原酸=咖啡酸=丹酚酸B>芍药苷=阿魏酸>干膏率，构建成对比较的判断优先矩阵，见表3。

表3 各指标3个层次的优先矩阵

2.6 基于层次分析法的 L9(34)正交试验分析

按“2.4.1”项下色谱条件测定各指标性成分的含量，按“2.3”项下方法计算供试品溶液的干膏率。采用归一化法计算每个指标分值，综合评分计算公式如下：综合评分=(绿原酸含量/最大绿原酸含量)×100×W1+(咖啡酸含量/最大咖啡酸含量)×100×W2+(芍药苷含量/最大芍药苷含量)×100×W3+(阿魏酸含量/最大阿魏酸含量)×100×W4+(丹酚酸B含量/最大酚酸B含量)×100×W5+(大干膏率/最大干膏率)×100×W6。以综合评分考察乙醇浓度、乙醇用量、浸渍时间和渗漉速度对渗漉提取工艺的影响，通过直观分析和方差分析优选出最佳渗漉提取工艺条件。结果见表4、表5。

表4 正交试验安排与结果

表5 方差分析

实验结果表明，各因素对盆消灌肠液提取工艺作用主次为A>C>B>D，即乙醇体积分数>浸渍时间>乙醇用量>渗辘速度，乙醇体积分数对提取效果的影响最大，而渗辘速度影响最小。方差分析表明，A因素对提取效果具有显著性影响(P<0.05)。根据直观分析结果，取各因素较高水平组合，最终确定最佳工艺参数为A2B2C3D1，即加8倍量70%乙醇，浸渍48 h后，以3 mL/min流速进行渗辘提取，收集渗漉液。

2.7 渗漉提取工艺验证

按最佳提取工艺制备3批样品，测定样品中绿原酸、咖啡酸、芍药苷、丹酚酸B、阿魏酸含量和干膏得率，结果表明该渗漉提取工艺稳定可行，见表6。

表6 提取工艺验证结果

3 讨论

中药复方具有多组分、多靶点的作用特点，设置多指标检测标准已成为优化中药复方制剂提取工艺的重要手段[10]。本研究采用主、客观结合的权重系数法-层次分析法，以确定多项指标的权重值。本制剂具有清热解毒、活血化瘀、止痛之功效，在各项指标两两比较判断矩阵中，大血藤、蒲公英、紫花地丁、败酱草、丹参主要发挥了本方“清热解毒，祛瘀止痛”之功效，且在方中用量较大，因此以大血藤、蒲公英、紫花地丁、败酱草共有成分[11-13]绿原酸、咖啡酸的含量和丹参的丹酚酸B的含量作为最重要的指标，计分最高；赤芍的芍药苷及当归的阿魏酸重要程度次之。提取液中的多糖、淀粉以及鞣质、树胶、树脂等成分并非本实验提取的最终目标，故干膏率重要程度要次于其他考察指标。因此，确定各指标优先顺序为：绿原酸=咖啡酸=丹酚酸B>芍药苷=阿魏酸>干膏率。结果显示，指标权重系数符合一致性评价要求，表明该评价方法具有可行性。

本研究确定盆消灌肠液最佳渗漉提取工艺为：处方量药材粉碎成粗粉，加8倍量70%乙醇作溶剂，浸渍48 h后，以3 mL/min的速度渗漉，收集渗漉液。该提取工艺条件经验证，合理可行，能为盆消灌肠液制剂大生产提供参考依据。