救必应水提液对小鼠肝脏病理损害的治疗作用研究

丘 芬，张兴燊,江海燕，梁欣娜，金 钊，闫守霞

(广西中医药大学 药学院，广西 南宁 530200)



救必应水提液对小鼠肝脏病理损害的治疗作用研究

丘 芬，张兴燊,江海燕，梁欣娜，金 钊，闫守霞

(广西中医药大学 药学院，广西 南宁 530200)

目的：研究救必应水提液对小鼠肝脏病理损害的治疗作用。方法：采用腹腔注射D-氨基半乳糖构建小鼠急性肝损伤模型，研究救必应水提液的保肝作用。结果：救必应水提液能降低D-氨基半乳糖实验性肝损伤小鼠血清谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)的活性，降低小鼠肝脏中丙二醛(MDA)含量，提高超氧化物歧化酶(SOD)活性，改善小鼠肝组织病理改变。结论：救必应水提液能抑制D-氨基半乳糖产生自由基造成的脂质过氧化反应，从而起到保护肝脏的作用。

肝损伤；救必应;小鼠；病理机制

救必应为冬青科常绿乔木植物铁冬青(IlexrotundaThund.)的干燥树皮，是南方常用的中草药,长江流域以南和中国台湾有着丰富的天然资源。其味苦、性寒,归脾、肾经,有清热解毒、凉血止血、行气止痛等功效,常用于癍痧发热、感冒发热、乳娥、脘腹胀痛、腹泻、痢疾的治疗,外用治烧烫伤[ 1-2 ]。民间瑶医用于治疗急、慢性肝炎有效[3-4 ]。现代药理研究多集中于其在心血管[5-6 ]、胃肠道及抗菌作用机制方面[7]，对救必应治疗肝炎的药理作用研究较少，本研究通过构建肝炎动物模型,观察救必应水提液对血清转氨酶及肝脏过氧化系统的影响,为进一步开发救必应治疗肝炎的临床应用提供药理学依据。

1 材料与方法

1.1 药品及试剂

救必应水提液由广西中医药大学药学院炮制教研室提供，浓度为2g原生药/mL，根据需要配成适当浓度；D-氨基半乳糖(批号20090921，供应商MBCHEM)； ALT(谷丙转氨酶)试剂盒(批号20120327)；AST(谷草转氨酶)试剂盒(批号20120326)；MDA(丙二醛)试剂盒(批号20120320)； SOD(超氧化物歧化酶)试剂盒(批号20120326)；考马斯亮兰试剂盒(批号20120323)，均购于南京建成生物工程研究所；联苯双脂滴丸(批号110602，浙江万邦药业有限公司生产)。

1.2 实验动物

SPF级昆明种小白鼠，18～22g，雌雄各半，由广西医科大学实验动物中心提供，实验动物合格证号：0006915。

1.3 仪器

台式离心机(珠海黑马医学仪器有限公司，型号：TGL-16k)、全波长酶标仪(EPOCH- BIOTEK)，双光束紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司，型号：TV-1901)，电子天平(METTLER TOLEDO，型号： EL204)。

1.4 小鼠急性肝损伤模型的建立及分组

取昆明种小鼠60只，18～22g，雌雄各半，随机分为六组，每组10只。设正常对照组、模型对照组、救必应水提液给药组(低、中、高剂量组)、联苯双脂阳性对照组。救必应水提液给药低、中、高剂量组分别采用6g生药·kg-1、4g生药·kg-1、2g生药·kg-1，正常对照组、模型对照组给予生理盐水，阳性对照组给予联苯双酯滴丸(0.2g·kg-1)，按20mL·kg-1灌胃给药，每天1次，连续给药7天。第7天给药后1h，正常对照组按10mL·kg-1腹腔注射生理盐水，其他各组小鼠按10mL·kg-1腹腔注射D-氨基半乳糖(500mg·kg-1)。动物禁食不禁水， 24h后眼球取血，分离血清用于检测ALT、AST活性。处死动物，取出肝组织，一半制成肝组织匀浆，检测肝组织SOD活性及MDA含量，另1半固定于10%甲醛溶液中48h以上，常规石蜡包埋，切片并染色，显微镜下观察病理改变并拍照。

1.5 统计学处理

2 结果

2.1 救必应水提液对D-氨基半乳糖致肝损伤小鼠血清ALT、AST活性的影响

由表1可知，模型组小鼠血清ALT、AST活性值较正常对照组明显升高 (P<0.01)；救必应水提液高、中、低剂量组，联苯双脂组ALT值均明显低于模型组 (P<0.05)；救必应水提液高、中剂量组，联苯双脂组AST值均明显低于模型组 (P<0.01)，救必应水提液低剂量组AST值也明显低于模型组(P<0.05)，详见表1。

组别剂量(g生药/kg)ALT(U/L)AST(U/L)正常对照组-49.77±10.5698.16±9.93模型组-70.67±12.26**150.71±19.86**救必应高剂量组656.27±13.44Δ110.00±16.48ΔΔ救必应中剂量组458.35±12.85Δ115.19±16.02ΔΔ救必应低剂量组260.73±7.61Δ128.53±15.08Δ联苯双脂组0.257.50±6.83Δ106.45±12.11ΔΔ

注：与正常对照组比较，**P<0.01；与模型组比较，ΔP<0.05，ΔΔP<0.01。

2.2 救必应水提液对D-氨基半乳糖致肝损伤小鼠肝脏MDA、SOD的影响

由表2可知，模型组肝组织MDA含量较正常对照组明显升高 (P<0.01)；救必应水提液高剂量组肝组织MDA含量明显低于模型组 (P<0.01)， 救必应水提液中剂量组肝组织MDA含量也明显低于模型组 (P<0．05)；模型组，联苯双脂组肝组织SOD活性值较正常对照组明显降低 (P<0.05)，救必应水提液高、中剂量组，联苯双脂组肝组织SOD活性值均明显高于模型组 (P<0.05)。

2.3 救必应水提液对D-氨基半乳糖致肝损伤小鼠肝组织病变的影响

正常对照组小鼠肝组织结构清晰, 肝细胞排列较规则，呈放射状排列。模型组小鼠肝细胞明显水肿和空泡样变性，细胞界限不清，肝细胞排列紊乱。 救必应低剂量组小鼠肝细胞与模型组相似，可见较多肝细胞水肿和空泡样变性，部分肝细胞核碎裂。救必应中剂量组仍可见少量肝细胞水肿和空泡样变性，肝细胞结构不清，排列不规则。救必应高剂量组和联苯双脂组小鼠肝细胞变性坏死明显减轻，肝细胞结构清晰，排列较规则。具体见图1。

组别剂量(g生药/kg)MDA(nmol·mgprot-1)SOD(U·mL-1)正常对照组--5.92±0.84140.71±12.71模型组--11.12±1.27**125.38±12.39*救必应高剂量组66.61±0.85ΔΔ142.90±15.10Δ救必应中剂量组49.77±1.0Δ139.15±10.45Δ救必应低剂量组211.01±1.42122.95±12.39联苯双脂组0.25.52±0.89ΔΔ143.53±13.69Δ

注：与正常对照组比较，*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较：ΔP<0.05，ΔΔP<0.01。

图1 小鼠肝组织病理比较( HE，×400 )

3 讨论

引起肝细胞损伤的致病因素不同，但导致肝细胞变性坏死的机理大致相同。自由基与肝细胞损伤密切相关。病理情况下产生的过多自由基若得不到清除，会随之产生一系列过氧化反应，影响到细胞的结构、代谢甚至功能。D-氨基半乳糖是肝细胞磷酸尿嘧啶核苷的干扰剂，进入人体后可与磷酸尿苷结合，限制细胞器及酶的生成和补充，导致肝细胞的结构和功能出现异常[8]，可造成肝脏弥漫性变性、坏死及炎症反应，与临床上急性普通型肝炎的病理变化类似。有研究发现， D-氨基半乳糖可通过诱生自由基从而引起肝损伤[9]。

ALT主要存在于肝细胞浆中，当肝细胞损伤时，细胞内转氨酶可进入血液中，引起血清中ALT水平升高。AST也存在于肝细胞浆内，并分布于线粒体内，当肝细胞严重损伤时，AST从线粒体内释放入血，可使血清AST水平升高[10]。SOD能催化清除超氧阴离子自由基，是重要的氧自由基清除剂[5]。MDA 是脂质过氧化物分解产物之一，如产生过多，可引起细胞代谢及功能障碍，可反映体内脂质过氧化损伤程度。

本实验结果显示，救必应水提液在4g生药·kg-1及以上剂量，具有较好的降低血清ALT、AST水平作用，并且可有效降低肝组织中MDA含量，增强肝组织SOD活性；救必应水提液在6g生药·kg-1以上剂量还能明显减轻肝损伤模型小鼠肝细胞变性坏死情况，减轻病理损害。这些表明救必应水提液具有明显的降酶保肝作用，其抗肝损伤机制与抗脂质过氧化的损伤密切相关。救必应水提液通过对抗自由基活性，加速自由基清除，减少脂质过氧化发生，从而减轻D-氨基半乳糖引起的肝细胞脂质过氧化损伤，降低血清转氨酶。救必应的保肝作用与抗氧化活性有关。

[1] 广东省食品药品监督管理局. 广东省中药材标准(第1册)[S].广州:广东科学技术出版社,2004:172-173.

[2] 黄闻健.救必应的民间应用[J].江西中医药,1996(S1):1471.

[3] 戴卫波,梅全喜,曾聪彦.救必应化学成分研究及临床应用进展[J].亚太传统医药，2008,4(12)：137-139.

[4] 陆继敏,刘国斌.瑶医药治疗慢性乙型病毒性肝炎的临床研究[J].河北中医,2006,28(4):253-254.

[5] 黄树莲.救必应醇提物抗心绞痛的实验研究[J].中草药,1981,12(2):261.

[6] 何冰,陈小复.救必应提物对心血管药理作用[J].中药材,1997,20(6):3031.

[7] 文东旭,陈仲良.救必应化学成分的研究[J].中草药,1991,22(6):246.

[8] 王振华,郭庆英,朱建伟.降酶口服液对鼠降血清转氨酶的实验研究[J].长春中医学院学报，2002,18(1)：37-38.

[9] 胡恒龙,陈仁敦,马边虎,等.D-氨基半乳糖诱导肝损伤的过氧化机理和锌的保护作用[J].中国药理学与毒理学杂志,1993(7)：81.

[10] 苗亮，刘永红，华蕾，等.葛花醇提取液对酒精中毒小鼠模型作用的研究[J].中国医药生物技术，2009，4(4):262.

(责任编辑：宋勇刚)

Protective Effect of Water Extract of Ilex rotunda Thund on Experimental Liver Injury of Mice

Qiu Fen，Zhang Xingshen ， Jiang Haiyan，Liang Xinna ， Jin Zhao，Yan Shouxia

(Medicine College of Guangxi University of Chinese Medicine ，Nanning 530200，China)

Objective:To study the the efficiency of water extract of Ilex rotunda Thund on protection hepatocytes from acute injury in animal model.Methods:The acute hepatic injury model was made by by injection of D-aminogalactose to study the liver protection of water extract of Ilex rotunda Thund.Results:Elevated serum ALT,GST activity in D-aminogalactose liver injury model were reduced by water extract of Ilex rotunda Thund. Water extract of Ilex rotunda Thund reduced MDA level and incrseaed SOD activity in hepatocytes in D-aminogalactose liver injury model significantly. Conclusion:the liver protection of water extract of Ilex rotunda Thund is contected to the function of inhibitory effect of lipid peroxidation induced by D-aminogalactose.

Liver Injury; Cortex Ilicis Rotundae; Mice; Pathogenesis

2014-10-25

广西壮族自治区中医药管理局中医药民族医药自筹经费科研项目(gzzc1122)

丘芬(1981-),女，硕士，广西中医药大学高级实验师，研究方向为中药药理学。E-mail：kadylv@163.com

R285.5

A

1673-2197(2015)05-0010-02

10.11954/ytctyy.201505005