构建及鉴定碱性成纤维细胞生长因子重组真核载体pCMV-sbFGF

朱李雯

(温州医科大学仁济学院，浙江 温州 325035)



构建及鉴定碱性成纤维细胞生长因子重组真核载体pCMV-sbFGF

朱李雯

(温州医科大学仁济学院，浙江 温州 325035)

目的：构建可分泌表达bFGF蛋白的重组真核表达载体，并检测哺乳动物细胞的表达情况，为缺血性脑卒中基因治疗提供新的途径。方法：运用PCR技术将bFGF基因进行扩增，通过重叠PCR技术将FGF-21的信号肽序列(FGF-21-SP)和bFGF基因连接，使用限制性内切酶和T4连接酶将重叠PCR产物FGF-21-SP-bFGF基因导入到pshuttle质粒载体中，再通过转染将重组真核载体转入293T细胞中，通过Western blot技术检测bFGF的表达。结果：成功构建带有分泌型bFGF基因的pshuttle质粒载体，Western blot检测显示在真核细胞293T中成功表达。结论：成功构建可分泌表达bFGF蛋白的重组真核表达载体，在真核细胞中高效表达，为开发可分泌表达bFGF蛋白的重组基因治疗载体奠定实验基础。

FGF-21信号肽；分泌型表达bFGF；pshuttle质粒载体；真核表达

脑血管病是目前被公认为危害人类健康和生命安全最严重的疾病之一[1]。全国第三次死因调查结果显示，在我国脑血管病患者死因多为恶性肿瘤和心脏病，占死亡总数的22.45%，成为我国城乡居民死亡的主要疾病。

碱性成纤维细胞生长因子[2](bFGF)是由155个氨基酸所组成的18kD多肽，主要分布在垂体、脑和神经组织及视网膜、肾上腺、胎盘等组织。因此，bFGF可促进来源于中胚层和神经外胚层多类型细胞增殖及分化，具有广泛生物学效应。bFGF主要由星形胶质细胞产生，通常成年哺乳动物脑组织呈较低水平表达，但脑组织受到损伤后bFGF表达显著上调。bFGF能促进血管生成、组织修复、神经保护、轴突再生、动员内源性神经干细胞，在中枢神经系统的发育与损伤修复过程中起着重要作用。bFGF除直接给药外，还可通过转基因方式将bFGF基因导入靶细胞中，再将带有转基因的靶细胞植入病变器官进行表达，达到治疗效果[3]。但由于bFGF缺乏信号肽序列，限制其分泌表达能力处于较低水平，并限制其他方面的应用[4]。

本实验，采用PCR技术将bFGF基因进行扩增，通过重叠PCR 技术将FGF-21的信号肽序列(FGF-21-SP)与bFGF基因进行连接，使用限制性内切酶和T4连接酶将重叠PCR产物FGF-21-SP-bFGF基因导入到pshuttle质粒载体中，再通过转染将重组真核载体转入293T细胞中，通过Western blot技术检测其bFGF的表达。检测结果显示，实验成功构建带有分泌型bFGF基因的pshuttle重组质粒载体，Western blot检测显示其在真核细胞293T中成功高效表达，为后续开发可分泌表达bFGF蛋白的重组基因治疗载体用于缺血性脑卒中奠定实验基础。现将实验报道如下。

1 材料

1.1 实验仪器

微量离心机，全能台式高速冷冻离心机，高速冷冻离心机，大容量恒温振荡器，PCR扩增仪，隔水式恒温培养箱，细菌培养箱，立式压力蒸汽灭菌器，小型水平，垂直电泳槽。

1.2 菌株与质粒

菌株为大肠杆菌DH5a，质粒pENTR-D-TOPO-bFGF-IRES-hrGFP、pshuttle-IRES-hrGFP-1，引物 S-bFGF R、 S-bFGF F、 FGF21-SP R、FGF21-SP F。

2 方法

2.1 载体构建及测序

2.1.1 pshuttle-FGF21-SP-bFGF-hrGFP质粒构建 在超净台进行操作，将质粒转化至DH5α扩增并提取pshuttle-IRES-hrGFP-1质粒。以质粒pENTR-D-TOPO-bFGF-IRES-hrGFP为模板，扩增bFGF基因。

FGF-21信号肽序列的合成及扩增：FGF-21信号肽序列合成(FGF-21-SP)atggactcggacgagaccgggttcgagcactcag gactgtgggtttctgtgctggctggtcttctgctgggagcctgccaggca；FGF-21信号肽序列进行PCR扩增。

FGF-21-SP-bFGF重叠PCR扩增：(1)重叠PCR扩增体系：

98℃ 15s

无引物 95℃ 2min → 50℃ 15s →5cycle

72 ℃ 2min

98℃ 15s

加入引物 95℃ 3min → 60℃ 15s →30cycle →72℃ 20min → 4℃∞

72℃ 150s

(2)FGF-21-SP-bFGF纯化；(3) 琼脂糖凝胶电泳鉴定。

质粒pshuttle-IRES-hrGFP-1 和FGF21-SP-bFGF分别进行Bgl II和Xho I双酶切：pshuttle-IRES-hrGFP-1质粒双酶切1h并纯化；凝胶琼脂糖电泳证实酶切产物，并分别予以浓度定量。

过夜连接质粒pshuttle-IRES-hrGFP-1 和FGF21-SP-bFGF。将质粒过夜连接产物转化感受态细菌DH5α。在FGF21-SP-bFGF的转化培养基中随机挑取4个单菌落，摇菌扩增，提取质粒pshuttle-S-bFGF-hrGFP。质粒pshuttle-S-bFGF-hrGFP进行Bgl II和Xho I双酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定，并将重组质粒送测序，-80℃保存菌种

2.1.2 质粒保存 pshuttle-S-bFGF-hrGFP送测序，-80℃保存菌种。

2.2 表达鉴定

293T细胞经培养后进行细胞转染，进行Western blot技术检测。

3 结果

3.1 载体构建及测序结果

3.1.1 pshuttle-S-bFGF-hrGFP质粒构建 pshuttle-S-bFGF-hrGFP质粒构建结果与理论大小相符合。

3.1.2 质粒pshuttle-S-bFGF-hrGFP送测序结果 pshuttle-S-bFGF-hrGFP质粒送上海生物工程公司测序，测序结果与预期值相符合。

3.2 表达鉴定

3.2.1 293T细胞转染结果 带有分泌型bFGF基因的质粒在真核细胞293T中成功转染，与预期结果一致。见图1。

3.2.2 Western blot技术检测 结果显示带有分泌型bFGF基因的质粒在真核细胞293T中成功表达。见图2。

4 讨论

bFGF反应是由细胞膜上受体介导的,目前已知受体有4种,分别为FGR-1、FGR-2、FGR-3和FGR-4,受体在各种组织中分布以及功能均不同。FGF家族中大多数成员均具备完整的信号肽序列,且能够通过经典内质网—高尔基体途径分泌到细胞外,但其中aFGF与bFGF大量分布在胞浆或核内。研究表明,aFGF与bFGF均缺乏信号肽序列,两者分泌可能存在其他运输途径,也可能是细胞损伤后释放到细胞外[5]。考虑bFGF的生物学功能是由受体所介导的,严重限制bFGF在组织工程、基因治疗、细胞治疗及其他各方面的应用。研究实验在bFGF基因5c端引入一段信号肽序列,目的基因在胞浆内进行合成后,分泌到培养液中,再将引入信号肽切除,操作并不影响bFGF的活性[6]。

293T细胞是由293细胞所派生的，表达SV40大T抗原的人肾上皮细胞系，293T细胞广泛用于表达各种目标蛋白，或包装病毒[7]。293T是贴壁细胞，对培养基营养成分要求不高。293T细胞的生长状态直接关系包装病毒及转染效率，因此应尽量选择传代次数少、培养总时间短的细胞。293T细胞应用广泛，但在正常培养条件下，难以将细胞传代下去，且包装病毒效率较低，转染效率也较低。因此，实验必须对细胞培养的设备环境进行定期清洁。此外，还要对器材进行彻底消毒，积极做好实验室各方面工作。

图1 293T细胞转染后在白光下pshuttle-FGF-21-S-bFGF100倍与pshuttle空质粒100倍显像

图2 Western blot技术检测结果

[1] 饶明俐.《中国脑血管病防治指南》摘要[J].中风与神经疾病杂志，2005，22(5)：388-393.

[2] 陈惠，杨耀防. bFGF的生物作用分子机制研究进展[J].九江医学，2009，24(1)：73-75.

[3] 孙奋勇，陈小佳，洪岸. bFGF在原代培养人皮肤成纤维细胞中的高效分泌表达[J].暨南大学学报：自然科学与医学版，2004，25(6)：668-674.

[4] MANSUKHAN A,ERA PD,MOSCATELLI D,et al.Characterization of the BEK fibroblast growth factor(FGF) receptor: activation by three members of the FGF family and requirement for herparin [J]. Proc Natl Acad Sci,1992,89:3305-3309.

[5] MUTHUKRISHNANL, WADER E, MCNEILPL.Basic fibroblast growth factor is efficiently released from a cytosolic storage site through plasma membrane disruptions of endothelial cells[J]. J Cell Phys, 1991, 148(5): 1-16.

[6] 董志宁，孙奋勇，潘秋辉，等. rh-bFGF转染人皮肤成纤维细胞的研究[J].生物医学工程研究，2004，23(1)：34-37.

[7] 徐兰，刘敏英. 293T细胞的培养[J].细胞生物学杂志，2009，31(1)：130-130.

(责任编辑：李岚春)

2014-09-21

浙江省大学生科技创新活动计划推广项目(新苗人才计划)“氧调控性bFGF基因修饰神经干细胞的研制及其潜在临床应用价值研究”(2012R413048)

朱李雯，女，温州医科大学仁济学院在读生，研究方向为中药学。

R329

A

1673-2197(2015)06-0016-02

10.11954/ytctyy.201506007