大孔树脂对中华常春藤总皂苷的纯化研究

孔令强，刘 明，周 英

（贵州大学 生命科学学院，贵州 贵阳 550025）

常春藤为五加科常春藤［Hedera nepalensis K.Koch.var.sinensis（Tobler）Rehder.］的干燥藤茎、叶［1］，常绿攀援藤本。常春藤属植物茎含鞣质、树脂、皂苷、肌醇、胡萝卜素等。常春藤属植物中被研究最多，而且发现种类较多的一类成分就是皂苷类化合物。该类化合物具有保肝、抗肿瘤、止痉、止痛、杀虫等多种药理活性［2］。童星等［3］利用气相色谱－质谱联用技术测定了常春藤挥发油的化学成分及其相对质量分数，国外研究人员分别从台湾常春藤、英国常春藤、尼泊尔常春藤中成功分离鉴别出8种齐墩果烷类皂苷7种木栓果烷类皂苷［4］－［6］，目前常春藤中所含齐墩果烷型皂苷hederacolchiside A1等被证实有较强的抗癌活性［7］。本实验选择两种树脂（AB－8、D101）对常春藤中皂苷的纯化进行研究，以期获得皂苷含量较高的部分。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

中华常春藤干燥茎，购于河北安国冷背中药材市场；常春藤皂苷C，Sigma公司；AB－8、D101型大孔树脂，南开大学化工厂；旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；TU－1810紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；FA2004电子分析天平，上海良平仪器仪表有限公司；GZX－9140MBE电热恒温鼓风干燥箱，上海博达实业有限公司医疗设备厂。

1.2 实验方法

1.2.1 大孔吸附树脂预处理

将大孔吸附树脂浸泡在95%乙醇中24h，待其充分溶胀后，用乙醇反复清洗至流出液加适量蒸馏水无混浊，再用蒸馏水洗尽乙醇，树脂湿法装柱后，用2%HCl溶液冲洗，蒸馏水洗至中性后再用5%NaOH溶液冲洗，用水冲洗至中性，树脂备用。

1.2.2 样品的制备方法

称取100g常春藤干燥茎，粉碎后以70%乙醇作溶剂，按固液比1∶15加入乙醇，浸泡2h后在50℃水浴中提取2次，每次3h，合并提取液，减压过滤后用旋转蒸发仪浓缩至密度为1.20，将产物依次用石油醚、正丁醇萃取后浓缩并干燥，用甲醇溶解，定容到50mL容量瓶中，即得待测液。

1.2.3 大孔吸附树脂对常春藤的静态吸附和解吸实验

（1）静态吸附和解吸实验。

取常春藤总皂苷制备液（2.00mg／mL）50mL装入锥形瓶中，分别加入2种型号的树脂各1g，室温置于摇床上振荡6h。将充分吸附后的树脂过滤，置于50mL锥形瓶中，再用70%的乙醇解吸，室温置于摇床上振荡6h，测定吸附前后样液的总皂苷浓度，选出吸附率和解吸率都好的树脂。按式（1）、式（2）计算树脂吸附率和解吸率。

其中：A为吸附率（%）、B为解吸率（%）；C0为起始浓度、C1为平衡浓度、C2为解吸液浓度（mg／mL）；V1为吸附液体积、V2为解吸液体积（mL）。

（2）静态吸附动力学曲线。

称取10.0gAB－8湿树脂于500mL锥形瓶中，加入总皂苷浓度为2.00mg／mL的样液200mL，室温置于摇床上，震荡12h，每小时定时取样2.5mL，测定吸附余液总皂苷的浓度，计算吸附率。

1.2.4 大孔树脂对常春藤总皂苷的动态吸附和解吸

将预处理好的AB－8树脂湿法装入（1cm×40cm）玻璃层析柱中，将常春藤总皂苷提取液上柱，对上样流速、浓度、洗脱液浓度及流速等进行动态吸附与解吸实验。实验中待样液全部通过树脂柱后，用去离子水洗至流出液无色，再用不同浓度的乙醇以一定速度洗脱，收集洗脱液，测定总皂苷含量。

1.2.5 中华常春藤总皂苷的测定方法

采用常春藤皂苷C为对照品香草醛－浓硫酸显色法。

（1）试剂的配制。

①常春藤皂苷标准溶液（50μg／mL）：准确称取一定干燥至恒重的常春藤皂苷C标准品2.5mg，于20mL烧杯中，加入甲醇10mL，微热使之溶解，用甲醇定容至50mL，摇匀并置于冰箱中保存；②8%香草醛溶液：准确称取无水香草醛8g于50mL烧杯中，加50mL蒸馏水溶解后，倒入100mL容量瓶中，定容至刻度，置于棕色瓶中并低温保存；③77%硫酸溶液：准确量取蒸馏水21mL于250mL烧杯中，缓慢加入98%H2SO479mL，静置后倒入100mL容量瓶中并低温保存。

（2）样品的显色测定法。

移取2mL待测液于比色管中，烘干溶液加入8%香草醛溶液0.10mL，1min后，加入77%硫酸3.00mL，摇匀，65℃水浴加热10min，再冰水浴15min，各取1mL移入试管，用77%硫酸定容到10mL，摇匀，静置10min后以试剂空白作参比，在440nm处测其吸光度。

（3）标准曲线的绘制。

准确量取（50μg／mL）常春藤皂苷 C标准溶液2.00、3.00、4.00、5.00、6.00、7.00于容量瓶中，其余操作同（2），以试剂空白作参比，在440nm处测其吸光度，结果见图1，并以吸光度值（A）为纵坐标，常春藤皂苷C浓度（μg／mL）为横坐标，绘制标准曲线，如图1所示，求得回归方程y＝0.0636x＋0.0108，R2＝0.9987。

图1 常春藤皂苷C对照品标准曲线

2 结果与分析

2.1 大孔吸附树脂的静态吸附实验结果

2.1.1 不同树脂对常春藤总皂苷的吸附率及解吸率

由图2可以看出，AB－8树脂具有较大的吸附率和解吸率，D101树脂的吸附率相对较低，从综合上考虑，本实验确定AB－8树脂为实验用树脂。

图2 两种大孔吸附树脂的吸附实验结果

2.1.2 AB－8树脂对常春藤总皂苷的静态吸附动力学特征

合适的吸附树脂除了具有较大的吸附容量、吸附率和解吸率外，同时还要有较快的吸附速率。实验对AB－8树脂进行吸附动力学实验，结果见图3所示。

图3 AB－8树脂的静态吸附动力学曲线

从图3可以看出，AB－8树脂对常春藤总皂苷的吸附为平衡型，在6h后基本到达平衡，到后期虽然有些缓慢下降趋势，但是起始阶段到中后期吸附量都较大，总体上看来，AB－8大孔树脂对常春藤总皂苷具有良好的吸附动力学特征，综合考虑，AB－8大孔树脂对常春藤总皂苷具有良好的吸附解吸特性，适合常春藤总皂苷的分离纯化。

2.1.3 吸附pH 的影响

不同pH条件对树脂吸附常春藤总皂苷的影响，结果如图4所示。

图4 不同pH值对常春藤总皂苷吸附率的影响

从图4可以看出，pH对吸附率的影响在pH值0～3之间较为明显，但在pH值3～7影响不明显，且吸附率普遍较高，常春藤总皂苷提取液的自身浓度为7，在此条件下的吸附率也较高，考虑到实际操作难易，因此实验选择提取液自身的pH条件。

2.2 AB－8大孔树脂对常春藤总皂苷的动态吸附结果

2.2.1 上样流速的影响

通过调节流速对上柱样液进行吸附流速的选择，上样浓度均为2mg／mL，制流速分别为1、2、3、4、5、6BV／h，进行动态吸附，六种流速下的吸附率如图5所示。

图5 不同上样速度对常春藤总皂苷吸附率的影响

由图5可知，流速为1BV／h时吸附率最大，但是1BV／h的流速过慢，上样时间长，导致循环周期延长，考虑到时间过长会影响实验进度所以选择3BV／h的流速比较合适。

治疗前，两组患者的UPDRS II和UPDRS III评分相比，差异无统计学意义；治疗后，两组患者UPDRS II和UPDRS III评分均显著降低，同组治疗前后比较差异有统计学意义（P＜0.05）；且观察组患者UPDRS II和UPDRS III评分显著低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。

2.2.2 上样浓度的影响

通过调节上柱样液浓度分别为1、2、3、4、5、6mg／mL，进行吸附浓度的选择，控制流速为3BV／h进行动态吸附，6种吸附浓度下的吸附率如图6所示。

图6 不同上样浓度对常春藤总皂苷吸附率的影响

由图6可知，随着上样浓度的增加，吸附率在不断增大，当上样浓度达到2BV／h时变化很小，且浓度越大越容易出现沉淀并导致柱层析的堵塞，所以选择上样浓度为2mg／mL比较合适。

2.2.3 洗脱液浓度的影响

分别用10%、30%、50%、70%、90% 的乙醇溶剂进行洗脱，解吸流速控制为3BV／h，分别将各次洗脱的组分合并，然后测定它们的吸光度，计算解吸率，结果如图7所示。

图7 不同乙醇浓度对常春藤总皂苷吸附率的影响

2.2.4 洗脱流速的影响

在确定洗脱剂的最佳浓度后，还需要对洗脱流速进行确定，用70%的乙醇洗脱，控制流速分别为1、2、3、4、5、6BV／h，进行动态解吸，六种洗脱流速下的解吸率如图8所示。

图8 不同洗脱速度对常春藤总皂苷吸附率的影响

由图8可以看出，以1BV／h和2BV／h的流速进行洗脱得到的解吸率均较高，考虑到循环周期问题，选择流速较大的2BV／h为宜。

3 结论

通过对所选两种树脂对常春藤总皂苷的吸附与解吸性能的研究，确定AB－8树脂为理想的常春藤总皂苷分离纯化的树脂，其吸附率为72.4%，解吸率为81%，吸附6h达到平衡。AB－8树脂对常春藤总皂苷纯化的最佳条件为：上柱液pH为7，上柱速度3BV／h，上样浓度为2mg／mL，以30%乙醇为洗脱液控制洗脱液流速2BV／h。在此条件下，常春藤总皂苷的含量由2%提高到37%，说明AB－8树脂可有效地分离纯化常春藤总皂苷。

［1］中华人民共和国卫生部药典委员会.中华人民共和国药典［M］.北京：化学工业出版社，2005.

［2］DANLOYS Q.Efects of alpha－hedefin，a saponin extracted from Hedera helix，on cells cultured in vitro［J］.Planta Med，1994，60（1）：45－49.

［3］童星，陈晓青.常春藤挥发油的提取及GC－MS分析［J］.精细化工，2007，24（6）：559－561.

［4］TOMIMORI T.Triterpene glycosides of Hedera taurica［J］.生药学杂志，1987，41（1）：55－57.

［5］KIZU H ，KITAYAMA S，NAKATANI F ，et al.Studies on nepalese crude drugsⅢ，On the saponins of Hedera nepalensis K.Koch［J］.Chem Pharm Bull，1985，33（8）：3324.

［6］HARUHISA K，SATOSHI H，MIZUMI S，et al.Studies on the Costituents of Hedera rhombea Bean IV［J］.On the Hederagenin Glycosides Chem Pharm Bull，1985，33（8）：3473－3478.

［7］A GEPDIREMEN，V MSHVILDADZE，H SU，et a1.Acute antiinflam matory activity of four saponins isolated from ivy［J］.Phytomedicine，2005，9（12）：440－444.