猪口蹄疫O 型、A型二价灭活疫苗免疫抗体检测试剂盒的应用评估

王红娜，陈 伟

1.河南省宝丰县动物疫病预防控制中心，河南 宝丰 467400；2.申联生物医药（上海）股份有限公司，上海 200241

口蹄疫（foot-and-mouth disease，FMD）是由口蹄疫病毒（foot-and-mouth disease virus，FMDV）引起的一种急性、烈性、高度接触性的动物传染病，具有传播速度快、传播方式多样、感染致病性强、潜伏期短、动物机体对口蹄疫病毒的免疫应答反应低等特点。该病发病率可达100%，仔猪常不见症状而猝死，严重时死亡率可达100%，对养殖业和国际畜产品贸易造成巨大的经济损失。因此，世界动物卫生组织（OIE）将其列为必须法定报告的动物传染病，我国将其列在一类动物传染病的第1 位。目前，我国主要采取以疫苗免疫为主、扑杀为辅的综合性防控措施，因此，口蹄疫疫苗免疫效果评估是防止口蹄疫发生和蔓延的一个重要环节，快速准确地检测评估疫苗免疫抗体水平至关重要[1-2]。本试验旨在通过对比评估7 个企业生产的口蹄疫抗体检测试剂盒的性能，为养殖场开展疫苗免疫效果评估提供科学的参考依据。

1 材料与方法

1.1 血清样品

278 份临床血清样品来源于7 个规模化猪场，免疫疫苗为猪口蹄疫O 型、A 型二价灭活疫苗（Re-O/MYA98/JSCZ/2013 株+Re-A/WH/09 株），免疫剂量为2 mL/头份，分别在一免及二免30 d 后按要求随机采血，并制备血清，2～8 ℃保存备用。

1.2 口蹄疫抗体检测试剂盒

7 个口蹄疫抗体检测试剂盒生产企业分别以企业A、企业B、企业C、企业D、企业E、企业F、企业G 代表，详见表1。

表1 口蹄疫抗体检测试剂盒

1.3 检测方法及结果判定

按照各企业生产试剂盒中说明书的具体检测步骤和注意事项进行操作，并根据相应的判定标准进行结果判定与分析。由于各企业生产的试剂盒对检测结果的判定标准有所差异，因此，对于待检样品的抗体平均值不做对比分析。

2 结果与分析

2.1 一免血清抗体检测结果

检测结果显示（表2），企业A、企业B 与企业D生产的试剂盒检测一免血清的O 型抗体阳性率分别为73.7%～100%、85%～100%、90%～100%，离散度分别为12.6～65.9、13.6～31.9、19.8～50.9；A 型抗体阳性率分别为73.7%～100%、94.7%～100%、100%，离散度分别为13.2～71.8、3.5～22.2、21.5～59.3。由此可见，企业A、企业B 与企业D 生产的试剂盒检测的抗体阳性率和离散度等主要指标均相对较好，而其他企业生产的试剂盒检测的抗体阳性率和离散度等主要指标均相对较差。

表2 各企业口蹄疫抗体检测试剂盒一免血清抗体检测结果

续表2

2.2 二免血清抗体检测结果

检测结果显示（表3），企业A、企业B、与企业D 生产的试剂盒检测二免血清O 型抗体阳性率分别为90%～100%、100%、100%，离散度分别为19.4～69.9、1.8～10.7、5.3～8.5；A 型抗体阳性率分别为80%～100%、100%、100%，离散度分别为21.3～77.3、1.3～2.7、6.6～8.2。由此可见，企业A、企业B 与企业D 生产的试剂盒检测的抗体阳性率和离散度等主要指标均相对较好，与一免血清抗体检测结果保持一致，而其他企业生产的试剂盒检测的抗体阳性率虽然都相对较好，但离散度都相对较差。

表3 各企业口蹄疫抗体检测试剂盒二免血清抗体检测结果

续表3

3 讨 论

血清学检测在口蹄疫检疫及免疫群体疫苗效力评估中发挥重要作用，其中病毒中和试验（VNT）是口蹄疫血清学检测的“黄金标准”，但该试验需要使用口蹄疫活病毒，按照国家规定必须在有相关研究资质的生物安全三级实验室中进行操作，这就限制了绝大多数普通实验室的检测使用。随着现代生物技术的快速发展，目前国内外已成功研究出一些可替代的检测方法进行口蹄疫疫苗免疫抗体的评估，如液相阻断酶联免疫吸附试验（LPB-ELISA），该方法不使用口蹄疫活病毒，具有敏感性高、特异性强等特点，是国际贸易中认可的一种标准化检测方法，该方法最大的优点是采用灭活的病毒抗原，而抗原是在液相中与抗体发生特异性结合反应，与病毒中和试验原理基本一致，因此又被称为体外病毒中和试验，这种方法就可以从要求较高的专业化生物安全实验室走向大众化的普通实验室来推广使用[3-4]。此外，固相竞争酶联免疫吸附试验（SPCELISA）也是世界动物卫生组织（OIE）指定的口蹄疫血清学检测评估方法之一，也是我国口蹄疫诊断技术（GB T18935-2018）中推荐使用的检测方法。这种方法除具备液相阻断ELISA 的优点以外，其检测特异性更好、操作更简单、重复性更好，目前也在口蹄疫流行病学调查及疫苗免疫抗体监测等方面广泛使用[5-6]。

本试验旨在通过对278 份疫苗免疫临床血清样品进行检测，对比评估7 个企业生产的口蹄疫抗体检测试剂盒的性能，检测结果显示，企业A、企业B 及企业D 生产的试剂盒对临床血清的检测结果，无论是O 型抗体还是A 型抗体，其抗体阳性率和离散度等主要评估指标均相对较好，而其他企业生产的试剂盒的检测结果相对较差，尤其是一免血清抗体检测结果，不同企业试剂盒的检测结果差异比较大，这可能与试剂盒的特异性、敏感性、检测反应体系或者包被的口蹄疫抗原种类等诸多因素有关，这些试剂盒的检测性能还有待进一步优化提升，从而确保检测结果的可靠性；而二免血清抗体检测结果均相对较好，大多数企业生产的试剂盒都可以检测评估。

目前，我国对于包括口蹄疫诊断试剂在内的大多数兽用诊断生物制品还没有制定统一明确的国家标准。因此，现有口蹄疫诊断制品还存在诸多问题，如生产企业多且大多数资质不健全；各企业试剂盒包被的口蹄疫病毒抗原不同、检测反应体系不同，导致检测结果差异较大，从而不能有效对口蹄疫疫苗免疫抗体进行科学评价，导致猪场免疫程序制定困难，或者需要反复调整，甚至造成免疫失败。因此，养殖场需要结合本场实际情况，通过对口蹄疫抗体检测试剂盒比对筛选，同时还可以结合口蹄疫疫苗有效146S 抗原含量、总蛋白含量、内毒素含量等关键技术指标的检测结果形成一套相对可靠的评价标准，以便制定科学合理的免疫程序，保障疫苗的免疫效果。