重庆动物园大鲵生存水体检测研究

王晓佳 计慧姝 欧 洁

1.重庆市动物园管理处，重庆 400000；2.四川省甘孜藏族自治州动物疫病预防控制中心，四川康定 626000

大鲵（Andrias davidianus）俗称娃娃鱼，属两栖纲、有尾目、隐鳃鲵科，是世界上现存最大也是最珍贵的两栖动物，属国家二级重点保护野生动物。近几年市民送入重庆动物园的大鲵越来越多，但是由于野生环境的恶化及运输过程中或送养前饲养条件较差，送来的大鲵多半患有严重的感染性疾病和外伤（皮肤病变或有外伤的占1/2 以上），2011年1月至2014年4月共死亡15 尾，死亡率达31%。因此，对大鲵常见致病菌的排查和研究，以及其生存环境的仿生态化研究刻不容缓。目前，根据国内外的相关研究资料来看，大鲵常见疾病主要有赤皮病、腐皮病、水霉病、线虫病、浮头病、弯体病和碱中毒等。其中，感染大鲵细菌性病病原菌主要为气单胞菌属，如嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）、温和气单胞菌（Aeromonas sobria）、维氏气单胞菌（Aeromonas veronii）、荧光假单胞菌（Pseudomonasflu orescence）等[1-3]。由气单胞菌引发的赤皮病、腐皮病及腹水病，一年四季都有发生，多是在大鲵捕获、运输、放养时身体受到机械损伤，或体表被寄生虫寄生受损时，病原菌入侵体表，引起大鲵发病。水霉菌引发的水霉病，全年均可发病，2、4月为流行高峰，主要是由水质恶化和机体受伤而诱发，水温过低也有可能引发该病。当水质太肥、水温过高时，易造成大鲵缺氧，引发浮头病。重度缺氧会引起大鲵体色变深、行动不便，轻度缺氧其头部浮出水面张大嘴艰难呼吸。当水体重金属盐类超标时，会刺激鲵的神经和肌肉收缩而导致弯体病，即鲵脊椎呈S 型弯曲[4]；当水质呈碱性时易诱发碱中毒疾病。

重庆市动物园长期承担饲养救护大鲵工作，目前园区共计饲养大鲵40 余条，根据重庆市动物园的实际条件，后备隔离饲养池采取人工水池饲养大鲵，饲养池采取长流水的方式进行水体更换，在换水通道处采用多层过滤棉层的方法过滤杂质。所有隔离池顶层加装网棚，确保树叶等杂物不会掉落入池。展出池则采取水泥池饲养，没有隔离池周边植物落叶的装置，采取定期彻底排空水体，清洗池壁的方法维持水体清洁度。目前的饲养环境是否能够为大鲵提供合适的生存环境尚不清楚。笔者希望通过对已有的大鲵发病情况、各个饲养池水体的自然带菌情况、饲养中健康大鲵的体表带菌情况、水体水质等结果进行综合分析，得到适合重庆市动物园的饲养大鲵方法。本研究的试验结果将对重庆动物园大鲵的救护起到指导作用，也为今后的人工繁殖工作打下基础。

1 材料与方法

1.1 试验对象

重庆动物园2014年6月共饲养35 条大鲵，以及至2019年6月项目进行过程中救护的大鲵均为试验对象。

1.2 试验方法

1）饲养池分组。将两爬馆大鲵饲养池分为2 组：①第一组，隔离池组，水池携带自来水过滤棉系统进行水质控制。按照从左到右、从入口到内室的方向分别编号为1～8。②第二组，展出池，自然放置，每周水全部排干1 次，并清洗池底，编号为9 号。

2）大鲵体表带菌情况分析方法。随机于各个隔离池内挑选目标大鲵2 条，用无菌棉签在大鲵体表（背面）头部、背部、四肢共计采集6 个位点的皮肤黏液样本，接种于LB 固体培养基平板，于37 ℃恒温培养箱内培养24 h，挑取形态不同的单菌落于LB 液体培养基内增菌培养，将细菌培养液送至生物检测公司进行细菌通用16S RNA 序列PCR 扩增并测序，测序结果与SCI GenBank 数据库中的数据进行比对分析，依据相似度最高的序列为菌种判定结果，低于95%的序列判断为未知菌种。

扩增引物选取细菌16S rRNA 基因通用引物[5]：

上游引物：5’—AGAGTTTGATCCTGGCTCAG—3’；

下游引物：5’—GGTTACCTTGTTACGACTT—3’。

PCR 扩增体系：选用TaKaRa 公司的Ex Taq 用于目的片段的克隆分析。

25 μL 体系：ddH2O 14 μL，10×Taq Buffer 2.5 μL，dNTP Mix(2 mmol/L) 2.5 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，MgCl2（25 mmol/L）1.5 μL，Taq DNA Polymerase（5 U/μL）0.3 μL，DNA 模板2 μL。

PCR 反应条件：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性40 s，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，循环35次，72 ℃延长10 min。

琼脂糖凝胶电泳检测PCR 反应产物，选取阳性结果进行基因测序。

3）饲养水体带菌情况分析方法。随机于各个饲养池内抽取水样1 mL，将20 μL 液体样本接种于LB 固体培养基平板，于37 ℃恒温培养箱内培养24 h，挑取形态不同的单菌落于LB 液体培养基内增菌培养，将细菌培养液送至生物检测公司进行细菌通用16S RNA 序列PCR 扩增并测序，测序结果与GenBank 数据库中的数据进行比对分析，依据相似度最高的序列为菌种判定结果，低于95%的序列判断为未知菌种。细菌鉴定试验方法同本文1.2.2）。

4）饲养水体菌落计数方法。采取平板菌落计数法进行水体菌落计数，随机于各个饲养池内抽取水样1 mL，将样本涂布于LB 固体培养基平板，于37 ℃恒温培养箱内培养24 h，计数平板上单菌落数量，根据溶液量计算出每毫升水体含菌量。

5）药敏试验方法。由于重庆市动物园隔离池位置集中且处于开放式环境，菌群生存环境互通，因此药敏试验分为2 组，分别为隔离池组和展出池组。

①药敏纸片制作。依据重庆市动物园常用水生药品种类，选择3 种常用药品作为检测药品，将中速滤纸打孔制作相同直径圆形纸片。选取带胶头塞废弃安倍瓶，清洗干燥后，每瓶放入10 片制作完成的纸片，封口后高压灭菌备用。按照表1调整药液浓度，采用0.22 μm 滤器过滤药液。在无菌环境下将制备完毕的药液灌放入有纸片的安倍瓶，药液必须没过纸片，封口后于烘干箱内烘干药液（烘干箱温度不得超过60 ℃），保证药液完全浸入纸片。

表1 药液质量浓度

②药敏试验。在展出池中取10 μL 水样，涂布LB 固体培养基，编号为饲养池组。隔离池8 个池水样混合后取10 μL 水样，涂布LB 固体培养基，编号为隔离池组。2 组培养基于37 ℃恒温培养箱内培养24 h，分别用100 μL 无菌生理盐水混匀菌落并涂布整板。于平板上粘贴药敏纸片，于37 ℃恒温培养箱内培养24 h，计数抑菌圈直径，依据抑菌圈直径判断药物是否敏感。

③药物敏感试验判定标准。抑菌圈直径（mm）在20 以上为极度敏感；15～20 为高度敏感；10～14为中度敏感；10 以下为低度敏感；低于或等于1 为不敏感。

6）饲养水体水质检测方法。随机选取室内饲养池3 个，饲养外池1 个，每个饲养池采集6 份600 mL水样，送重庆渝久环保产业有限公司进行pH 值、总磷、总氮、化学需氧量、五日生化需氧量、高锰酸盐指数等6 项水质分析检测。依据《地表水环境质量标准GB3838-2002》对地表水环境质量标准基本项目标准限值判断送检水样质量水平。

2 结果与分析

2.1 临床病例分析

由于档案数据不完善，2014-2015年死亡报告不完整，因此死亡原因从2016年开始分析。2016年1月至2019年6月共计救护大鲵78 条，救护的大鲵医治无效死亡共计43 条，最常见原因为腐皮病以及腐皮病引发的黏膜层脱落（表2）。

表2 2016-2019年大鲵死亡情况统计条

2.2 大鲵体表带菌情况

1 号池：1 号大鲵体表分离到1 株亚硝化单胞菌目的细菌。

4 号池：1 号大鲵体表分离到1 株水生鱼类肠道菌群中1 种细菌。

6 号池：2 号大鲵分离到1 株嗜水气单胞菌和1株荧光假单胞菌。

8 号池：2 号大鲵分离到1 株气单胞菌。

2、3、5、7 号池内饲养的大鲵体表未分离到细菌。

2.3 饲养水体带菌情况

1 号池：分离到弗氏柠檬酸杆菌。

2 号池：分离到假单胞菌。

3 号池：分离到气单胞菌、假单胞菌。

4 号池：分离到气单胞菌、弗氏柠檬酸杆菌、气单胞菌。

5 号池：分离到气单胞菌、弗氏柠檬酸杆菌、假单胞菌。

6 号池：分离到气单胞菌、恶臭假单胞菌。

7 号池：分离到芽孢杆菌、柠檬酸杆菌、假单胞菌。

8 号池：分离到柠檬酸杆菌。

2.4 水体菌落计数

水体菌落计数显示（表3），6 号池菌落数最多，9 号池菌落数最少，分别为521 个/mL 和32个/mL。

表3 菌落计数结果

2.5 细菌药敏试验

展出池黄粉抑菌圈为10 mm，达到中度敏感，剩余2 种药物未出现抑菌圈，判定为不敏感（图1）。隔离池3 种药物均未出现抑菌圈，判定为3 种抗生素均不敏感（图2）。

图1 展出池药敏试验结果

图2 隔离池药敏试验结果

2.6 饲养水体水质检测

4 组水样水质检测结果见表4，根据《地表水环境质量标准GB 3838-2002》对地表水环境质量标准基本项目标准限值的要求，1 号、9 号水样总磷总氮含量为Ⅱ类水质，2 号、4 号水样总磷总氮含量为Ⅴ类水质，1、2、4、9 号水样其余4 项指标均为Ⅰ类水质。

表4 水质检测结果

3 讨 论

3.1 救护大鲵入园体况决定其存活率

救护收入的大鲵超过半数在进园时已经有严重外伤或者严重疾病，表现出体质弱、疾病多、外伤严重、进食困难等多种情况。新入园的大鲵中50%以上在入园第1 个月内死亡，其中一部分在刚入园时就已经处于无法挽救状态，而入园体况较好的大鲵存活率较高。

3.2 大鲵生存环境的菌群情况

根据水体菌种鉴定和大鲵体表菌种鉴定结果，饲养池和隔离池中分离到的细菌种类有2～3 种，全部为水体常见菌种。只有4 条大鲵体表成功分离到细菌，占所有检测大鲵的25%。无论是水体中还是大鲵身体表面携带的细菌，均属于单胞菌属和柠檬酸杆菌属这两大类。这两属细菌均为水体中常见的条件致病菌，在大鲵体质较弱或者外伤的情况下会造成大鲵的皮肤溃烂症状，引发大鲵死亡[4]。其中，柠檬酸杆菌菌属是一种水生动物常见肠道菌群，该属细菌中只有弗氏柠檬酸杆菌是水生动物的一种常见病原菌[6]。以上几种鉴定得到的病原菌的种类都不多，基本符合正常水体带菌情况，因此，对在该水体中生存的大鲵并不会形成严重的危害。

通过细菌计数发现，展出池细菌数量少于隔离池。出现这种情况证明人工添加过滤棉网可能并不会减少细菌的数量，甚至由于过滤棉网使用的时间过长，反而会造成水体中细菌的增加。而展出池中细菌量相对较少，可能是由于水体内有少量青苔等地衣类植物，其对营养物质的竞争性争夺，可能会有一定的抑制细菌过度增长的作用。

由于水产用药范围较窄，重庆市动物园长期使用的抗生素药品只有3 种，通过对水体微生物进行药敏试验，发现3 种常用控菌药物只有黄粉仍有较低的抑菌作用，而另外2 种已经无法控制水体内的微生物，因此寻找和更换更加有效的药物成为当务之急。

3.3 大鲵饲养水体水质检测分析

有机物污染是水体中最容易出现的污染物质，许多有机污染物可在水体被底泥吸附而沉积下来，在今后若干年内对水生生物造成持久的毒害作用，而富营养化也是水体中较为常见的水质污染现象，会导致水生态系统物种分布失衡，单一物种疯长，破坏了系统的物质与能量的流动，使整个水生态系统逐渐走向灭亡。根据《地表水环境质量标准GB3838-2002》对地表水环境质量标准基本项目标准限值的要求，重庆市动物园大鲵饲养池的水质富营养化较为严重，但是水体并未被有机物污染，重庆市动物园部分隔离池水体氮磷总量皆超标，已经为Ⅴ类水质的标准，远远高于重庆市其他公园中景观水体的氮磷总量[7]，但是化学需氧量和高猛酸盐指标均为Ⅰ类水质的标准。造成这种情况的原因可能是由于重庆市动物园的饲养池隔离池均为封闭式水体，且大部分水体尤其是隔离池的饲养密度较大、水体相对较小，这种结构更容易导致营养富集，虽然水质并未受到有机物污染，但是过高的富营养化程度导致水体内各种微生物繁殖加快，增加了大鲵感染病菌的可能性。