YY超雄黄颡鱼精子保存液和激活液的筛选及在生产上的应用

古勇明　陈柏湘　韩林强　刘冰南　黎　洁

1.广东省佛山市南海百容水产良种有限公司，广东佛山528216；2.华中农业大学水产学院，武汉430070

YY超雄黄颡鱼精子保存液和激活液的筛选及在生产上的应用

古勇明1陈柏湘1韩林强1刘冰南1黎洁2

1.广东省佛山市南海百容水产良种有限公司，广东佛山528216；2.华中农业大学水产学院，武汉430070

分别以精子活力和受精率为标准，对5种精子保存液在不同稀释倍数下保存超雄黄颡鱼精子的效果及不同浓度NaCl激活液的应用效果进行了比较研究。结果表明，B保存液效果最好，精子活力和寿命保持时间最长，8倍稀释液在4℃条件下，96h内可保持80%以上的活力；低浓度NaCl溶液能延长精子的寿命，在0.3% NaCl溶液中激活精子活力最强。本实验筛选的超雄黄颡鱼精子保存液和激活液在全雄黄颡鱼生产中具有良好的推广应用价值。

YY超雄黄颡鱼；精子；保存液；激活液；受精率

黄颡鱼（Pelteobagrusfulvidraco）隶属于鲶形目、鲿科、黄颡鱼属，俗称嘎鱼、黄姑、黄蜡丁，是一种小型底层经济鱼类，其肉质细嫩、味道鲜美、营养丰富，肌间刺少，深受消费者喜爱，已成为我国名特优水产品重点养殖对象之一，2013年全国黄颡鱼总产量超过50万t[1]。

在相同养殖条件下，全雄黄颡鱼的养殖效益显著高于普通黄颡鱼[2-3]，使得全雄黄颡鱼苗种市场需求量不断增加。全雄黄颡鱼人工繁殖生产需杀超雄黄颡鱼取精，剪碎研磨，再用精子保存液清洗和稀释，若处理不当将会影响精子活力，造成受精率低下，同时造成YY超雄鱼亲本浪费，增加生产成本。

有关黄颡鱼等鲇形目鱼类精子保存液和激活液的研究已有报道[4-7]，但超雄黄颡鱼（YY）与一般黄颡鱼雄鱼（XY）在遗传基础上存在本质差异，两者精子组成不同，保存液效果是否一致，目前还未见相关的研究报道。

本研究初步探讨了5种保存液及不同浓度激活液对超雄黄颡鱼精子活力的影响，以筛选出效果最优的保存液和激活液参数，并在人工繁殖生产中应用，指导苗种生产。

1　材料与方法

1.1材料来源

YY超雄黄颡鱼为佛山市南海百容水产良种有限公司研发育成，使用前利用分子标记鉴定确认。在繁殖季节，选取体表无伤、无病、个体健康、性成熟的YY超雄黄颡鱼，体重为200～250g。精子保存容器为经洗涤和高温灭菌处理后的10mL可密封青霉素玻璃瓶。

1.2精子保存液的制备

根据鱼类精子保存的生理需要，参考相关文献[4-7]，配制了A～E共5种精子保存液，具体配方成分组成见表1。

1.3超雄黄颡鱼精子采集

采用人工催产的方法进行精子采集。催产激素及剂量为：LHRH-A24μg/kg，DOM1.0mg/kg，到达效应时间时，先用干毛巾擦干鱼身，然后剖腹取出乳白色的精巢，剔除血污等，置于吸水纸上吸去水分，在孔径为0.150mm的干净网布中挤出精子，4℃冰箱保存备用。

1.4精液的保存

使用定量移液枪将精液分别用保存液A～E进行4、8倍稀释，保存瓶置于冰箱（4℃）保存，设置3个平行。

1.5精子活力观察

用1mL微型注射器针尖挑取少量精液，放至事先滴好低渗溶液的计数板上，激活精子，在数码显微镜下拍摄出精子在各种低渗溶液中的运动状况。用精子激活后的活力（快速运动精子占总精子数的百分比）为指标对保存效果进行评价。“+++”表示100%精子快速运动；“++”表示80%精子快速运动；“+”表示50%精子快速运动；“+-”表示10%～30%精子快速运动；“-”表示少量精子在原地振动或全部死亡。精子的激活率、强烈运动期、慢速运动期和寿命的观察参照相关文献[8]。

1.6人工授精受精率统计

每组各取卵子约500粒于培养皿中，分别加入0.1mL精液，并加入10mL水激活，迅速振荡使卵子和精子充分结合并黏于培养皿底部后统一置于塑料大盆中，定期换水、充气，保证溶氧。受精卵处于原肠中期时，在解剖镜下抽样观察并计数受精卵，计算其受精率，受精率=（原肠中期卵数目/总卵数）×100%。每组设置3个平行。

1.7试验设计

1）不同保存液对超雄黄颡鱼精子保存效果的影响。

在低温（4℃）条件下，观察5种精子保存液4、8倍稀释保存的结果。前12h每隔2～4h观察1次，以后12～24h时观察1次，记录结果。获得超雄黄颡鱼精子活力的时间变化规律，确定最优保存液和最佳保存时间。

2）不同保存时间对人工授精效果的影响。

利用筛选的最优保存液保存精液，评估不同保存时间的授精效果。选择发育良好的雌鱼3尾和超雄鱼2尾，注射催产激素，2次注射，针距10h，第1针LHRH-A210μg/kg，第2针LHRH-A25μg/kg、 DOM2.0mg/kg和HCG1500IU/kg，效应时间后挤卵，选择卵质良好、数量较多的同一尾雌鱼卵用于实验。在培育皿中各取约500颗卵粒分别与不同保存时期保存的精液和新鲜精液授精，加水激活，然后放入塑料盆中孵化，统计受精率，每组设置3个平行。

3）不同低渗激活液对超雄黄颡鱼精子活力的影响。

考察超雄黄颡鱼精子在不同盐度激活液中的激活情况，统计精子快速运动时间、慢速运动时间和平均寿命，筛选出最佳的激活液浓度。

4）不同低渗激活液对人工授精效果的影响。

生产过程中选择发育较好的雌鱼，注射催产激素，效应时间后，选择卵质良好的卵用于实验，干法授精，分别用不同浓度激活液（0.0%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%）激活，统计受精率，每组设置3个平行。1.8数据统计

试验数据在SSPP19.0软件中整理并作多重比较分析，显著水平为P=0.05。

表1　精子保存液配方组成情况

2　结果与分析

2.1不同保存液对超雄黄颡鱼精子保存效果的影响

超雄黄颡鱼精子在不同保存液中的保存效果见表2。低温条件下（4℃），5种保存液4倍和8倍稀释保存下的精液在前24h内精子活力均很强，激活后几乎100%的精子在作快速运动；24h后活力出现下降趋势，但不同保存液中的精子活力变化有所不同，不同稀释倍数间也开始出现差异。

1）保存液A：4倍稀释保存中，24h后活力下降趋势明显，48～72h激活后80%的精子在作快速运动；96h激活后仅约50%的精子作快速运动；120h精子基本死亡。8倍稀释保存中，保存48h后精子活力下降不明显，激活后仍有接近100%的精子在作快速运动；72～120h活力下降明显，激活后作快速运动的精子量从80%逐步降低到10%；144h精子基本死亡。

2）保存液B：4倍稀释保存中，24h后活力下降趋势明显，48～72h激活后80%的精子在作快速运动；96～120h激活后约50%的精子作快速运动；144h精子仍有约10%的精子可以快速运动。8倍稀释保存中，保存48h后精子活力下降不明显，激活后仍有接近100%的精子在作快速运动；72～96h激活后80%的精子在作快速运动；120～144h激活仍可观察到约50%的精子在作快速运动。

3）保存液C：4倍稀释保存中，24h后精子活力下降，48～96h激活后超过80%的精子在作快速运动；120h激活后仅约50%的精子作快速运动；144h后仅有不到10%的精子可以快速运动。8倍稀释保存中，24h后精子活力变化不大，48h仍可观察到100%的精子快速运动，72～96h激活后超过80%的精子在作快速运动；120h激活后仅有约50%的精子作快速运动；144h观察仅有不到10%的精子可以快速运动。

4）保存液D：4倍稀释保存中，24h后活力下降趋势明显，48～72h激活后80%的精子在作快速运动；96h激活后约50%的精子作快速运动；120～144h仅有约10%～30%的精子可快速运动。8倍稀释保存中，24h后精子活力下降较明显，48～120 h激活后作快速运动的精子量从80%逐步降低至10%；144h精子基本死亡。

5）保存液E：4倍稀释保存中，24h后活力下降趋势明显，48～72h激活后50%的精子在做快速运动；96h激活后仅有约20%的精子作快速运动；120 h 精子基本死亡。8倍稀释保存中，24h后活力下降趋势明显，48h激活后80%的精子在作快速运动；72～96h激活后仅有约50%的精子作快速运动；120h激活后仅有约10%~30%的精子作快速运动；144h精子基本死亡。

表2　超雄黄颡鱼精子在不同保存液中的保存效果（4℃）

6）原精：保存8h精子活力未见明显降低，8h之后活力下降明显，12h激活后80%左右精子作快速运动，24h激活后约50%精子作快速运动，48h观察基本看不到快速运动的精子了。

实验结果表明保存液B对超雄黄颡鱼精液的保存效果相对较佳。稀释倍数方面，除了保存液D的4倍稀释效果略优于8倍稀释外，其他保存液的结果均显示8倍稀释较4倍稀释的效果好。综合以上结果，筛选出保存液B的8倍稀释作为超雄黄颡鱼精液的保存液。

2.2不同保存时间对人工授精效果的影响

不同保存时间的精液人工授精的受精率见图1。

从图1可知，对照组的受精率始终保持在约90%的水平，且不同时间的差异较小。低温条件下，保存液B的8倍稀释保存精液在48h内的受精率（84.5%～94.6%）与原精（85.3%～94.3%）相比差异极小，受精效果均较好。48～96h与原精相比，受精率呈现一定下降趋势，120h后保存精液的受精率急剧下降，144h受精率降低至约60%。结果表明，保存液B的8倍稀释保存精液最好在2～3d内使用，保存时间过长，受精效果存在一定的风险，同时使用前要求镜检精子的活力情况，该结果与观察到的不同保存时间精液的精子活力结果基本吻合。

图1　不同保存时间的精液人工授精的受精率

图2　不同浓度NaCl激活液条件下人工授精的受精率

2.3不同低渗激活液对超雄黄颡鱼精子活力的影响

超雄黄颡鱼精液在不同浓度NaCl溶液中激活的情况见表3。

结果显示，低渗溶液能不同程度地提高超雄黄颡鱼精子的活力与寿命。各试验组的精子强烈运动时间显著高于对照组，以0.2%浓度组和0.3%浓度组最高，分别为32.3±4.6、38.7±3.8s，相比对照组延长了9～15s；精子慢速运动时间同样以0.2%浓度组和0.3%浓度组最高，其次是0.4%浓度组，均显著高于对照组。精子寿命以0.3%浓度组最高，0.4%和0.2%次之，同样显著高于对照组。

精子被激活数量的观察结果显示，随着低渗激活液浓度增大激活比例呈下降趋势，但0.0%~0.3%浓度组精子的激活率下降不明显，均保持在90%以上，而0.4%～0.5%浓度组精子的激活率显著下降，仅60%左右。

2.4不同低渗激活液对人工授精受精率的影响

不同低渗激活液激活条件下全雄黄颡鱼人工授精受精率的结果统计见图2。

结果表明不同低渗激活液条件下获得的受精率存在差异（69.9%～77.1%），激活液在0.0%～0.3%的浓度范围，受精率随着浓度的升高而上升；在0.3%～0.5%的浓度范围，受精率随浓度的升高而下降，其中以0.3%浓度组的受精率最高，0.2%的次之，两者显著高于对照组。

表3　超雄黄颡鱼精子在不同浓度低渗溶液中的活力1）

3　讨论

3.1不同保存液及稀释比例对超雄黄颡鱼精液保存效果的影响

本研究考察了4℃条件下5种精子保存液保存超雄黄颡鱼精液的效果，与对照组相比，5种保存液均可延长YY超雄黄颡鱼精液的保存时间。各保存液之间存在一定差异，保存液B的保存效果相对最佳，其次是D，再次是C、A、E。不同保存液间效果的差异与保存液的配方组成有关。精液的保存需要适当的渗透压、离子组成、pH、能量供给等一系列条件，保存液的组成越接近精浆的组成，保存时间就会越长[9]。本实验中5种精子保存液均在相关研究中证实对精液短期低温保存具有良好效果，但对于超雄黄颡鱼精液的保存效果存在一定的差异。超雄黄颡鱼精子在含葡萄糖溶液中的寿命较其他保存液中相对较长，可能葡萄糖除提供适宜的渗透压外，还起着额外的作用。这与苏德学等[11]在黄颡鱼精子保存中的研究结果类似，推测黄颡鱼精子具有利用细胞外源性葡萄糖的能力，以弥补在活动过程中消耗的部分能量，从而使精子寿命得到延长。Gardiner[12]也认为体外受精鱼类的精子具有三羧酸循环代谢的能力，可以通过氧化作用利用细胞外源性碳水化合物，尤其是葡萄糖、半乳糖和果糖，这三种单糖可以是精子活动存活的可选择和次级的能源。

保存液不同的稀释倍数对保存效果同样存在影响。本研究结果表明，除了保存液D的4倍稀释效果略优于8倍稀释外，其他保存液8倍稀释均较4倍稀释效果好，这与丁淑荃等[4]在实验中获得的黄颡鱼保存液以5～7倍的稀释比例较好的实验结果一致。

3.2保存精液对受精率的影响

对照组的受精率始终保持在90%左右的高受精率水平，且不同时间点的差异极小，表明实验过程中选择的雌鱼和雄鱼发育情况良好，精卵质量优良。精子保存过程中运动受到一定的抑制作用，精子的运动和渗透压的维持是一个耗能的过程，保存液中精子活力随保存时间的延长出现不同程度的下降，推测跟精子的能量消耗有关。低温条件下，保存液B8倍稀释保存的精子在48h内的受精率（84.5%～94.6%）与鲜精（85.3%～94.3%）相比差异极小，受精效果均较好。在48～96h与鲜精相比受精率略微下降，120h后则急剧下降，144h受精率下降至60%左右。该保存液保存的精子在72～96h激活后80%的精子在作快速运动，由此可推测全雄黄颡鱼人工授精要达到满意的受精效果，使用的精液应满足激活后80%以上的精子可以快速运动，另外保存的精液最好在2～3d内使用，保存时间过长，受精效果存在一定的风险，同时使用前要求镜检精子的活力情况。鲁大椿等[13-15]的研究结果表明家鱼人工授精时，精卵的量比以30万～40万时受精率最高。大部分的鲤科鱼类的精子浓度在60%～70%，密度大都在200亿～400亿/mL之间，即每毫升原精可以使50万～100万粒鱼卵受精。超雄黄颡鱼的精液量相对家鱼少得多，精液不能挤出，人工繁殖过程中合适倍数的稀释精液将大大提高生产的效率，减少精液的浪费。

3.3超雄黄颡鱼精子在不同浓度NaCl溶液中活力

由于精巢中具有诸多抑制精子活动的因素，精子的运动被抑制[5]，鱼类的精子在精巢中是不运动的，但具有很强的运动潜能[16]。当精子排出体外，在适当的条件下精子便开始运动，这一过程称之为激活[17]。渗透压是调节鱼类精子活力的主要因子，鱼类精子激活比例随外界溶液渗透压的变化而变化，在一定范围内淡水鱼精子激活比例随外界溶液渗透压的降低而上升[18]。本实验结果表明不同浓度NaCl溶液对精子的活力与寿命有非常显著的影响。在0.1%～0.5%的NaCl溶液中，精子寿命均高于直接用水激活。从精子被激活强烈运动时间来看，在0.3% NaCl溶液中精子强烈运动时间最长为38.7s，在0.5%溶液中精子强烈运动时间最短为26.0s。从精子数量来看，在0.0%～0.3%NaCl溶液中被激活的精子在93%以上，在0.4%～0.5%NaCl溶液中被激活的精子占50%～60%。由此得出0.3%NaCl溶液是超雄黄颡鱼精子的最佳激活液，可提高人工繁殖效率，在生产上大规模应用。

本研究中超雄黄颡鱼精子在浓度为0.0%～0.5%的低渗溶液中，被激活后保持活力的时间和精子激活率的结果与黄颡鱼基本一致，最适盐度范围为0.2%～0.3%[8]，但与瓦氏黄颡鱼精子激活的最适盐度范围为0.45%～0.55%不同[19]，这与鱼类不同的生态习性存在一定关系，一般认为鱼类精子激活最适的条件与其繁殖的环境相一致。

3.4结论

鱼类精原细胞经过一系列阶段成为精子。染色体为XY♂的黄颡鱼，产生X、Y两种精子，而YY♂超雄鱼仅产生Y精子。大量研究表明，X、Y精子存在多方面的差异，如精子膜表面电荷、精子核和头部的形态学差异、对pH值的敏感性、Y精子中独特的乳酸脱氢酶和H-Y抗原、精子密度、泳动速度、运动特性、DNA含量等[20-21]。两种不同雄鱼的精子组成所适应的保存条件要求是否一致，需要通过实验确认。研究结果表明，黄颡鱼精液保存效果良好的保存液对于超雄黄颡鱼的精子保存同样具有较好的效果，其中以保存液B的8倍稀释，0.3%NaCl激活液，可以提高繁殖生产的效率，适合在生产中推广应用。但两者的保存液要求是否完全一致及是否有更加良好的超雄黄颡鱼的精子保存液配方，还需进一步深入研究。

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2015-06-08

高雄性率黄颡鱼的杂交育种及规模化人工繁育技术推广，清远市科技计划项目（2013C007）古勇明，男，1960年生，中级工程师。