饲料中细菌总数检测不确定度的评定

王 燕 毛 勇 张美丽 李 飞 邓 媛

陕西省微生物研究所，西安710043

饲料中的细菌数量会影响饲料的品质，若严重超标就会影响到动物、甚至人类健康。现行《饲料卫生标准》GB 13078-2017 中规定：饲料中细菌总数须小于2×106CFU/g[1]。可见，细菌数量可以直接决定该饲料产品是否合格。国家要求检测机构应根据需求建立评定测量不确定度的程序[2]，不确定度值越小，试验数据的准确性越大。因此，实验室评定不确定度，可以更科学、更准确地验证实验室检测能力。本文依照《饲料中细菌总数的测定》GB/ T13093-2006 标准[3]，测定了20 份饲料中的细菌总数的含量，并计算评定了这20 份数据的不确定度。

1 材料与方法

1.1 样 品

客户送检的20 份饲料。

1.2 仪 器

精密电子天平、恒温培养箱（30±1 ℃）、高压蒸汽灭菌锅、水浴锅（46±1 ℃）、振荡器、无菌操作台。

1.3 耗材与培养基

丝口瓶、1 mL 移液枪及其配套灭菌枪头、灭菌试管、玻璃珠、灭菌培养皿、灭菌营养琼脂（北京陆桥生产，批号：18091710）、0.85%无菌生理盐水、酒精棉球，所有材料进行121 ℃、15 min 高压灭菌待用。

1.4 检测方法

在含有225 mL 0.85%无菌生理盐水的蓝口瓶（含玻璃珠）中加入25.0 g 样品，在摇床上振荡30 min，充分混匀后作为1∶10 稀释液待测。用移液枪吸取1 mL 1∶10 稀释液至含有9 mL 灭菌生理盐水的试管中作10 倍稀释，振荡摇匀作为1∶100 稀释液。按上述方法，作系列10 倍稀释，直到稀释至1∶100 000浓度。将（1∶1 000）～（1∶100 000）这3 个浓度的稀释液分别吸取1 mL，放入一次性无菌平皿中，每个稀释度作2 个平行。然后将适宜温度的约15 mL 培养基倒入平皿，将培养基与稀释液充分混匀。待琼脂凝固后，倒置平皿于30 ℃恒温培养箱内培养72 h，结果按照国标相关菌落计数法则计数。

1.5 测量不确定度的评估方法

1）测量不确定度的来源。影响不确定度的因素很多，可以从人、机、料、法、环这5 个方面分析原因，该20 份饲料细菌检测的不确定度来源如下。

①人的因素：尽管为同一试验人员操作，但是同一稀释度做2 个平行样会引入不确定度。

②仪器及器皿因素：天平称量、量筒量取是该类不确定度的主要因素，本次检测使用同一个天平和量筒，故该项影响值是固定的。

③物料因素：取样的均匀性、使用的培养基都可产生不确定度。本次检测由同一人员操作，使用同一批培养基，而且每个包装培养基都做了空白对照，故该方面影响可忽略不计。

④方法因素：本次检测参照同一检测方法执行，故该方面影响可忽略不计。

⑤环境因素：本次检测在同一环境下进行操作，故可忽略该方面影响。

2）测量不确定度的评定方法。由上述分析可知，本次检测的不确定度来源主要是由同一稀释度平行样因素和天平称量、量筒量取造成。前者属于A 类不确定度，可以用统计分析方法评定；后者属于B 类不确定度，不使用统计方法评定，而是用其他方法评估概率分布假设来评定标准差来评定。最终的不确定度是二者的合成不确定度。

2 结果与分析

2.1 A 类不确定度

本次20 份饲料细菌检测是由同一个人检测，每个样品每个稀释度需要测2 个平行，数据的A 类不确定度由2 个平行数据产生。为了让数据更真实可靠，检验机构应针对每个领域进行不确定度评定。新西兰某实验室提出：可以用菌落总数的对数来计算合并样本标准偏差，可以减少重复性标准偏差的自由度，便于计算[4]。本次试验数据见表1。

根据贝塞尔公式，计算检验数据对数值的重复性标准偏差，结果如下：

根据检验数据对数值的平均值，计算得到其重复性标准偏差，结果如下：

S值即为A 类不确定度。

2.2 B 类不确定度

本次检验的B 类不确定度主要是测量仪器分辨力导致，UB=0.5×δx/k（δx 表示步进量，即最小的示值变化量；均匀分布处理，k=）)。在无菌室称量样品25.0 g 至含有225 mL 无菌生理盐水中，该过程使用的电子天平量程为300 g（其步进量为0.01 g），量筒容量为500 mL（其步进量为5.0 mL），其标准不确定度分别为0.5×0.01/=0.002 9 g、0.5×5.0/=1.443 3 mL。检测时用1 mL 移液器，相关标准规定其容量允许差为1.0[5]，即0.01 mL，其标准不确定度为0.01/=0.005 8 mL。稀释过程中标准不确定度如下[6]：

表1 20 份饲料的细菌总数检测结果

UB=[（0.0029/25）2+（1.4433/225）2+0.00582]1/2=0.008 6。

UB 的值为0.008 6，对于UA 0.064 1 而言非常小。而且只要是同一人用同一仪器做同样的试验，数值也是固定的，所以在某些文章中不计算B类不确定度，而直接用A 类不确定度作为最终的不确定度。

2.3 合成标准不确定度

合成标准不确定度（Uc）是指当测标准量结果是由几个其他量的值求得时，按照其他各量的方差和协方差计算得到的标准不确定度。它是测量结果标准偏差的估计值，表征了测量结果的分散性。

合成标准不确定度UC=（UA2+UB2）1/2=（0.06412+0.00862）1/2=0.064 8。

2.4 测量不确定度报告（扩展不确定度）

扩展不确定度U=kUC=2×0.0648=0.129 6（置信概率达P=0.95，包含因子k=2），依据《GB/T 27418-2017 测量不确定度评定和表示》规定[7]，本次测量结果对数值lgX报告为：（±0.1296）CFU/g（包含因子k=2），以第一组数据为例子：=2.3890，其对数值的取值范围在 （[2.3890-0.1296),(2.389 0+0.1296)]，即[2.2594,2.5186]，转换成自然值取整数为：182～330 CFU/g（包含因子k=2）。

3 结 论

影响饲料中细菌菌落总数测量不确定度的因素较多，文中对饲料细菌菌落总数测量不确定度的主要来源进行评定和分析。其中A 类不确定度的标准偏差为0.064 1，B 类不确定度的标准偏差为0.008 6，由此计算得到合成标准不确定度为0.064 8。通过这一试验使得实验室在饲料细菌检测领域建立了初步的不确定度，大大提高了检验数据的准确性。今后要不断增加该领域的原始检测数据，扩大检测样本，以便获得更准确的不确定度。