丁酸钠对IPEC-J2细胞β-防御素表达的调节作用

孙 健 高 敏

1.北京农业职业学院牧医系，北京102442；2.中国农业大学动物医学院，北京100083

抗生素在防治仔猪早期断奶综合征、消化道疾病，保障动物健康方面发挥了重要作用[1-2]，但抗生素的不当使用破坏了动物肠道的微生态平衡，造成了病原菌耐药和畜产品的兽药残留等问题，严重影响畜产品的品质和人类的健康[3]。尤其是近年来“限抗令”的颁布，寻找新的防治消化道疾病的方案已迫在眉睫。抗菌肽作为动物机体天然免疫系统的重要组成部分，具有抗菌活性强、抗菌谱广、无耐药性、无残留和毒性小等优点[4-5]，在机体对抗感染及炎症的过程中发挥了重要作用。防御素是抗菌肽家族的重要成员[6]，β 防御素是猪体内一类重要的内源性抗菌肽，是抵御病原微生物侵袭的一道重要防线[7]，在天然免疫中起着重要作用。最近研究发现所有防御素中β 防御素的分布区域最广，大多数猪源β-防御素（porcine β-defensin，pBD）是良好的抗生素替代品，在猪消化系统、生殖系统、呼吸系统等组织黏膜和上皮细胞中大量表达[8]，pBD1、pBD2、pBD3 是β-防御素家族中最为常见的3 种。

丁酸钠（丁酸）在维持动物肠道健康、提高动物生产性能方面发挥了重要作用，2003年丁酸钠被农业农村部列入《饲料添加剂品种目录》，具有良好的应用前景。猪空肠上皮细胞（IPEC-J2）具有典型的猪小肠上皮细胞特性[7]。因此，本研究以猪空肠上皮细胞IPEC-J2 为模型，进行不同浓度的丁酸钠对体外培养的IPEC-J2 的剂量依赖性刺激试验，利用实时荧光定量PCR 从mRNA 水平分别研究不同浓度丁酸钠刺激猪小肠上皮细胞后pBD1、pBD2、pBD3基因表达水平的差异。

1 材料与方法

1.1 材 料

1）试验细胞株。猪小肠上皮细胞IPEC-J2，农业农村部饲料工业中心惠赠。

2）主要试剂。DEM/F12 培养基，购自美国Gibco公司；epidermal growth factor，购自美国Peprotech公司；HEPES 缓冲液，购自美国sigma 公司；胎牛血清，购自美国Gibco 公司；Phosphate Buffered Saline 1X，购自美国Hyclone 公司；胰酶溶液，购自美国GIBCO 公司；二甲基亚砜，购自美国Sigma 公司；丁酸钠，购自sigma 公司；RNA 提取试剂盒，购自北京天根生物科技公司；反转录试剂盒，购自Proteintech公司；荧光定量试剂盒购自北京康为世纪科技有限公司。

3）主要设备。二氧化碳培养箱（FORMA3110，美国Thermo）；超净工作台（SW-CJ-1FD，江苏安泰空气技术有限公司）；倒置显微镜（TS2，日本Nikon 公司）；PCR 仪（美国BIO-RAD）；荧光定量PCR 仪（Roche LC96，美国罗氏公司）；10 cm 细胞培养皿、12 孔培养板、0.22 μm 滤膜，均购自美国Corning 公司。

1.2 方 法

1）IPEC-J2 细胞培养与丁酸钠添加。细胞培养基组成：DMEM/F12+10% FBS+1% insulin-transferrin-selenium+16 mmol/L HEPES+5 ng/mL epidermal growth factor。丁酸钠添加方法：取相同数目细胞接种于六孔板中，5% CO2培养箱中37 ℃静置培养，至细胞铺满底层80%时用于试验，吸弃培养液，PBS 洗2～3 次，加入用无菌去离子水丁酸钠溶液，使培养基内丁酸钠的终浓度分别为（1、2、4、8、16、32 mmol/L），细胞培养24 h 后，添加含有丁酸钠的培养基后继续培养24 h，收集细胞，提取RNA，定量，反转录得到cDNA，Q-PCR 进行检测。

2）丁酸钠刺激后细胞总RNA 的提取和反转录。RNA 提取按照试剂盒说明书操作。提取的样品用1%琼脂糖电泳观察所提RNA 的质量，用Nano Drop 测A260nm和A280nm吸光度，以测定RNA 纯度和浓度。将对照组与丁酸钠处理组提取的总RNA，根据反转录试剂盒说明书进行反转录，得到cDNA。以提取的总RNA 为模板，反转录合成cDNA 的体系为20 μL，反应条件为50 ℃15 min，85 ℃5 s。cDNA 于-20 ℃保存备用。

3）PCR 引物设计与合成。参照Gen-Bank 中所提供的基因序列设计特异性引物，内参为GAPDH。目的基因及内参基因引物由生工生物工程（北京）股份有限公司设计合成（表1）。

4）实时荧光定量PCR 检测pBD1、pBD2、pBD3基因mRNA 表达水平。用荧光定量PCR 仪检测在不同浓度丁酸钠处理后pBD1、pBD2、pBD3其mRNA表达水平，对每个样品cDNA 进行目的基因和内参基因荧光定量PCR 反应。20 μL 反应体系：Mix（2X）10 μL，Primer-F 1 μL，Primer-R 1 μL，cDNA 4 μL，ddH2O 4 μL。反应条件：进行PCR 扩增，95 ℃预变性；95 ℃10 min，58 ℃30 s，72 ℃30 s，40 个循环。PCR 扩增反应结束，根据扩增曲线的CT 值计算定量结果，并对数据进行统计学分析。目的基因及内参基因在同一条件下不同管内扩增，每个样品设2 个重复。

1.3 数据处理

目的基因的相对表达量采用2△△CT法计算：△CT（目的基因）=CT（目的基因）－CT（内参基因）；△△CT＝△CT（丁酸钠刺激组）－△CT（对照组）目的基因的相对表达水平＝2-△△CT。实时荧光定量PCR 结果均用“平均值±标准误（Means±SE）”表示，其中各基因的表达量所示结果均经内参基因表达量的校正。采用GraphPad Prism 8 分析作图，采用SPSS 15.0 的单因素ANOVA过程进行方差分析，以P＜0.05 为显著性标准。

2 结果与分析

2.1 猪小肠上皮细胞总RNA 的检测

所提取的Total RNA 用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测，RNA 样品电泳条带清晰。紫外分光光度计检测样品A260nm/A280nm，比值在1.8～2.0，表明无DNA残留，无蛋白污染，可以满足试验要求。

2.2 不同浓度丁酸钠对IPEC-J2 细胞pBD1 表达的影响

分别用不同浓度的丁酸钠刺激猪小肠上皮细胞，24 h 后收集细胞，提取总RNA，反转录后QPCR 检测pBD1、pBD2、pBD3mRNA 的表达。不同浓度丁酸钠对pBD1表达的影响结果如图1，可见1、2、4 mmol/L 丁酸钠处理组，pBD1表达与对照组没有显著性差异。

2.3 不同浓度丁酸钠对pBD2 表达的影响

不同浓度丁酸钠对pBD2 表达的影响结果如图2。可见1、2、4 mmol/L 丁酸钠处理组，pBD2 表达与对照组没有显著性差异。

表1 目的基因及内参基因引物序列

图1 不同浓度丁酸钠对pBD1 表达的影响

图2 不同浓度丁酸钠对pBD2 表达的影响

2.4 不同浓度丁酸钠对pBD3 表达的影响

不同浓度的丁酸钠对pBD3 表达的影响结果如图3。可见1、2、4 mmol/L 丁酸钠处理组，pBD3 表达均显著高于对照组，4 mmol/L 丁酸钠处理组pBD3表达最高，丁酸钠浓度与IPEC-J2 细胞pBD3 表达呈现正相关。

3 讨 论

丁酸钠制剂在调整胃肠道微生态平衡、预防肠道感染以及减轻胃肠道炎症反应等方面发挥了重要作用，丁酸钠作为肠道免疫调节剂和黏膜免疫佐剂，已广泛用于畜禽饲料中以提高动物生产性能。从本次试验结果来看，丁酸钠对常见的pBD1、pBD2、pBD3 3 种猪源β 防御素的调控作用并不一致，丁酸钠对pBD1、pBD2 调控作用不明显。研究还表明丁酸钠对IPEC-J2 细胞pBD3 的表达有调控作用，可以诱导防御素pBD3 的表达，而且调控作用与丁酸钠的浓度有密切关系，在本试验丁酸钠设定的浓度范围内呈正相关，这与Zeng 等[9]报道一致。另有研究表明，丁酸盐能够短时间内显著提高A549细胞抗菌肽hBD-1 的表达[10]，且hBD-1 的表达量在丁酸盐处理后的36～48 h 最高，但由于本试验只进行了IPEC-J2 细胞丁酸钠处理24 h 后检测，未进行时间依赖性试验，故不能给出结论。

图3 不同浓度丁酸钠对pBD3 表达的影响