山羊精液冷冻保存技术研究进展

纪云飞

陕西省榆林市草原工作站，陕西榆林719000

我国对山羊精液冷冻保存技术的研究是从20世纪80年代开始的，然而，到目前为止，在大多数试验中，山羊的冻精解冻后的活率都不能稳定地超过50%[1]。山羊精液的冷冻保存流程主要有：精液采集、精液质量检查、冷冻、复苏及复苏后的活率检查等环节。影响山羊精液冷冻保存效率的因素众多，本文将从山羊精液冷冻保存的流程出发，对我国山羊精液冷冻保存技术多年来的研究进展及影响山羊精液质量的因素进行小结，以期为该技术后续快速发展提供帮助。

1 山羊精液冷冻前的准备

山羊精液冷冻之前需要先采集精液，然后判断精液是否适合冷冻保存。对于适合冷冻保存的精液用一定的程序进行冷冻保存，而不适合冷冻保存的精液则弃掉。该阶段主要包括：假阴道的安装、精液采集、精液质量的外观评定及精子活力镜检。

1.1 假阴道安装

山羊假阴道的外壳为黑色胶皮水管，长约28 cm，内径5.2 cm。外壳中部外有一孔，安装气门及注水用。内胎为厚约1 mm 的胶皮，内径为5.0 cm的胶皮管。安装时将其放进外壳内，再将其开口端翻出，套在外壳口子上，用橡皮筋固定，另一端安装集精杯，以便握在手中。将45～50 ℃的热水从外壳上的小口注入假阴道，然后装上气阀，吹气，使内胎膨胀突出于假阴道，呈三角形或四边形，在假阴道开口端向内1/3 处涂抹凡士林，手指伸入感到温暖，有润滑感，有一定的压力，此时内胎温度为40～42 ℃[2]。

1.2 精液采集

用手握假阴道采精时，采精员应蹲在羊台畜右后侧，当公羊爬跨台畜时使假阴道与公羊阴茎伸出方向成一条直线，并将其紧靠、固定于台畜臀部右侧，用掌心托住包皮迅速将阴茎导入假阴道内，切勿用手抓握阴茎。当公羊向前俯冲后，即行射精。采精动作力求迅速、敏捷、准确，防止公羊阴茎突然弯折而受到损伤。射精时将假阴道集精杯一端向下倾斜，当公羊跳下时，假阴道随着阴茎后移，放掉假阴道内的空气，阴茎自行软缩脱出后，即可取下假阴道。

1.3 精液质量的外观评定

颜色：通过肉眼辨别精液的颜色，绒山羊的精液通常为乳白色或灰白色。如果呈现红色或绛红色则说明公羊患有炎症，应舍弃精液。

云雾状：取原精液1 滴滴于载玻片上，在低倍镜下观察液滴的边缘部分，精子上下翻腾滚动如云雾状，云雾状越明显，说明密度越大，活力越好。

射精量：可将所采集的种公羊精液吸入1～2 mL 一次性注射器中，通过注射器的刻度读出山羊射精量。

气味：通过嗅觉辨别山羊精液气味。正常精液略带腥味，羊精液略有膻味，但无其他异味。

其他：精液中不应有毛发、尘土和其他污染物。

1.4 精子活力镜检

取半滴原精液于载玻片上，用等温的2～3 滴0.9%生理盐水稀释，盖上盖玻片，将稀释好的精液置于显微镜下37 ℃恒温载物台上，在400 倍镜下检查至少5 个视野，估计每个视野下直线运动精子占总精子数的比例。统计5 个视野下精子的平均活力，即为精子活力。检查合格的精液才能用于冷冻保存，一般要求精子活力在60%以上。

2 山羊精液的冷冻保存及复苏

2.1 山羊精液的冷冻

山羊精液的冷冻保存通常有2 种方式，即颗粒冷冻和细管冷冻，实际操作中为防止微生物的污染，通常选用细管冷冻。杨素芳等[3]通过比较一步稀释法和两步稀释法冷冻保存山羊精液复苏后的效果，证实了两步法稀释能较好地冻存山羊精液。然而，为了生产中应用的方便，目前关于山羊精液冷冻保存多采用一步稀释法稀释。但稀释比例、稀释液的种类及添加剂等各有不同，且鉴于各实验室的冷冻习惯、仪器设备的良莠不齐，所使用的冷冻程序等也各有不同。

张圣朝[2]用精液∶稀释液=1∶3 的比例，选出最适用于阿尔巴斯白绒山羊冻精稀释液的配方：Tris 3.028 5 g，柠檬酸1.659 3 g，果糖0.75 g，蔗糖2.567 3 g，青、链霉素各10 万单位，双蒸水100 mL，pH 值6.6。最佳的卵黄含量为25%，最佳的甘油含量为6%。采用此配方冷冻阿尔巴斯绒山羊精液后精子活力能够达到33%。向该稀释液中添加海藻多糖、谷氨酸、Vc等添加剂后能够明显提高精液的质膜完整率及顶体完整率，然而活力甚至达不到基础液的活力。席利萌[4]通过对奶山羊精液的冷冻保存研究，结果证实了3%的乙二醇和6%的甘油均可作为冷冻保护剂对山羊精液冷冻具有明显的促进作用，添加红景天多糖后可明显改善山羊精液冷冻后的活力。柴局[5]通过对内蒙古绒山羊精液冷冻保存的研究，证实了Tris 3.07 g、柠檬酸1.64 g、葡萄糖0.5 g、果糖0.66 g，卵黄5%作为冷冻稀释液冷冻山羊精液能够达到最优效果，复苏后精子活力达到了41.2%，添加62.5 mmol/L 海藻糖后其活力能够达到44%，添加5 mmol/L L-谷氨酸后其活力能够达到48%。徐振军等[6]用葡萄糖3 g、柠檬酸3 g 及100 mL 去离子水制成基础液，按照基础液40 mL，各加入10 mL 新鲜卵黄，青霉素、链霉素各50 000 IU，摇匀后再分别取上液94 mL，加甘油6 mL 制成冷冻稀释液，对山羊精液冷冻后其活力能够达到50%以上。

目前认为卵黄中含有一些物质能与精清中的蛋白质结合而对精子起毒副作用，孟克格日乐等[7]通过不同的离心方法离心精液去除精浆，证实了750 r/min 离心1 次后冻存的精子在复苏后其活力、质膜完整率、线粒体活性等明显高于1 500 r/min 组，提示山羊精液对离心的耐受率在低转速下较高。薛健等[8]的研究也证实了去除部分精浆有助于提高山羊精液冷冻后的活力及受胎率，完全去除精浆后精子活力反而不高，可能是精子微环境发生巨大改变而产生不适应的后果。

2.2 山羊精液冷冻后的复苏

目前各家对于山羊精液的解冻方法不尽相同，尚未形成公认的结论。常用的山羊冷冻精液解冻方法是从液氮中取出冷冻细管，立即放入39 ℃水浴或者55 ℃水浴中解冻，然后进行各指标的检查。陈倩等[9]通过对不同解冻方法进行筛选，发现采用70℃4 s 解冻法比37 ℃12 s、39 ℃8 s 这2 种解冻法解冻后精子的活力明显要高些，证实了70 ℃4 s 的解冻方法能有效缓解解冻对精子的损伤，对保持精子的正常形态和活力较为有利，是绒山羊细管冻精适宜的解冻方法。然而也有学者认为山羊精液的理想解冻温度是40～50 ℃，温度越高，则解冻后精液质量越差[3]。

3 影响山羊精液冷冻保存效率的因素

影响山羊精液冷冻保存效率的因素总的来讲可以分为2 个方面，即山羊精液自身对冷冻的耐受性和冷冻前山羊精液的质量。一般来说，山羊个体对于精液冷冻的适应性有明显差异，胡润环[10]对阿尔巴斯绒山羊精液冷冻的研究结果，揭示了不同个体的绒山羊精液冷冻后精子活力差异显著，这可能与个体内耐冻基因的差异有关[11]。

冷冻前山羊精液的质量与冷冻后精液质量关系密切，通常冷冻前精液质量越高，冷冻后精液的质量也越高。因此，要想获得理想的冷冻效果，冷冻前山羊精液的质量亦需要高。李碧波等[12]研究发现日粮能量水平对试验公羊的血清睾酮水平和有效精子数影响极显著，对射精量和精子密度影响显著。在12.08 MJ/d 的日粮能量水平下，山羊的射精量、精子密度和有效精子数均达到最佳。闫治川等[13]通过补硒试验证实给山羊公羊注射亚硒酸钠维生素E 注射液后，血清硒水平迅速上升，第20 天达到最高峰。公羊血清T 和FSH 浓度显著高于对照组，精子活力明显升高，从而证实了硒元素对于公羊精液质量的重要性。

由此可见，影响山羊精液质量的因素众多，只有对遗传水平与营养水平进行联合把控才能够较好地调控山羊精液质量，从而使其更适合于冷冻保存。

4 山羊精液冷冻保存技术的发展前景

鉴于目前山羊精液冷冻保存的效率参差不齐，各家所用冷冻方法具有较大差别，但大多集中于冷冻保护剂及添加剂的筛选方面。随着对精液冷冻保存过程的认识不断加强及精液冷冻保存技术的不断进步，我们相信，一定能够筛选到一种适合于山羊精液冷冻保存的稀释液配方及与之相匹配的冷冻、复苏程序，使得山羊精液的冷冻保存技术成为一种成熟的、程序化的常规工作，为我国羊养殖业的持续提升提供助力，促进国民经济健康发展。