奶牛结核病不同检疫方法比较

路广计 王晓芳 马宏伟 张 涛 范京慧 刘天驹 轩秋燕范葶莉 邵丽玮 程丽华 边青岩

1.河北省动物疫病预防控制中心，石家庄050000；2.河北省畜牧兽医研究所，河北保定071000；3.河北省石家庄市动物疫病预防控制中心，石家庄050000；4.河北农业大学，河北保定071000；5.沧州职业技术学院，河北沧州061000；6.河北省饶阳县农业农村局，河北饶阳053900

牛结核病主要是由牛型结核分支杆菌引起的一种人畜共患、慢性、消耗性传染病，病原菌可通过空气、接触或牛奶感染人畜，严重威胁着动物和人类健康[1]。牛结核病的监测和净化在活畜上需要依赖快速、敏感、特异性强的诊断方法。目前广泛应用的诊断方法主要包括结核菌素皮内变态反应（TST）、欧盟皮内比较变态反应试验（SICTT）和牛γ干扰素酶联免疫吸附试验（IFN-γ-ELISA）。TST 作为OIE 指定法定检疫方法，优点是敏感性高，但操作费时费力，特异性差，容易出现假阳性或早期感染易漏检[2-3]。SICTT 是TST 方法的改进，可排除检疫中禽结核干扰导致的非特异性变态反应的影响，以避免不必要的淘汰和损失，目前欧盟等国普遍作为活畜检疫确认试验[4]。IFN-γ-ELISA 检测试剂盒是外周血γ- 干扰素体外释放检测法在实际中的应用，操作简单、敏感性和特异性高，目前已经得到全世界的广泛认可[5]。本研究同时采用以上3 种方法对河北省石家庄市栾城县某奶牛场进行平行检测，比较不同检疫方法对奶牛结核病阳性率的影响，为今后检疫和奶牛结核病的净化提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材 料

1）试验奶牛。中国荷斯坦奶牛300 头，试验奶牛外观健康，无任何结核病临床症状，统一TMR 饲喂，自由饮水。

2）主要试剂。牛型提纯结核菌素（牛PPD，青岛瑞尔生物技术有限公司，批号：P201906-001）；禽型结核菌素（禽PPD，青岛瑞尔生物技术有限公司，批号：P201906-001）；牛结核分枝杆菌IFN-γ 检测试剂盒（青岛瑞尔生物技术有限公司，批号：P201906-001）。

3）器材。剃毛刀、注射器、游标卡尺、酶标仪，CO2培养箱、细胞培养板、肝素钠采血管、移液器、枪头等。

1.2 方 法

3 种方法同时进行，在颈部右侧进行SICTT试验，同时尾根静脉采血进行IFN-γ-ELISA 试验。

1）SICTT。参照《动物结核病诊断技术》（GB/T18645-2002） 操作，采用牛型PPD、禽型PPD，统一在牛颈部右侧分点皮内注射，2 个注射点间隔12～15 cm。注射量分别为牛PPD 0.1 mL/头（2 000 IU），禽型PPD 0.1 mL/头（2 500 IU）。注射前剃毛、测量初始皮皱厚，注射后72 h 测量反应皮皱厚。注射前和试验测量由专人完成。

2）IFN-γ-ELISA。尾根采血于肝素钠抗凝管中，8 h 内送实验室，严格按照IFN-γ-ELISA 试剂盒说明书操作并测定和记录OD 值。

1.3 结果判定

1）TST判定。阳性：局部有明显的炎性反应，皮厚差≥4.0 mm为阳性；可疑：2.0 mm≤皮厚差＜4.0 mm；阴性：皮厚差＜2.0 mm。

2）SICTT 结果判定。先按照TST 标准判定。阳性：牛型PPD 反应阳性，牛型PPD 皮厚差－禽型PPD 皮厚差≥4 mm；可疑：牛型PPD 反应阳性，1.0 mm＜牛型PPD 皮厚差－禽型PPD 皮厚差＜4.0 mm；阴性：牛型PPD 反应是阳性或阴性，牛型PPD 皮厚差≤禽型PPD。

3）IFN-γ-ELISA。牛结核阳性：牛型OD 值－禽型OD 值≥0.1，且牛型OD 值－PBSOD 值≥0.1。牛结核阴性：牛型OD 值－禽型OD 值＜0.1 或牛型OD 值－PB 的SOD 值＜0.1。禽结核阳性：禽型OD值≥牛型OD 值，且禽型OD 值－PBSOD 值≥0.1。

2 结果与分析

2.1 牛TST、SICIT、IFN-γ-ELISA 试验结果

由表1 可知，牛TST 检测阳性103 头，阳性率为34.3%；SICTT 检测阳性牛93 头，阳性率为31%；IFN-γ-ELISA 检测阳性牛153 头，阳性率为51%。

2.2 3 种不同检测方法阳性检出率的对比分析

从表2- 表4 的检测结果统计可以看出，TST 和SICTT 检测相比，均为阳性的有93 头，阳性符合率为94.89%；均为阴性的有197 头，阴性符合率为97.52%。TST 与IFN-γ-ELISA 对比，均为阳性的有45 头，阳性符合率为31.16%；均为阴性的有89 头，阴性符合率为51.74%。SICTT 与IFN-γ-ELISA 对比，均为阳性的有40 头，阳性率为38.83%；均为阴性的有94 头，阴性符合率为53.10%。

表1 不同试验方法检测结果 头

表2 TST 与SICTT 对比 头

表3 TST 与IFN-γ-ELISA 对比 头

表4 IFN-γ-ELISA 与SICTT 对比 头

2.3 综合对比分析

1）TST 判定为阳性牛的分析。如表5 所示，TST判定为阳性的牛共计103 头，其中40 头牛SICTT和IFN-γ-ELISA 均判定为牛型阳性，确定为阳性；34 头SICTT 判定为阳性，IFN-γ-ELISA 判定为阴性，确定为阳性；19 头牛SICTT 判定为阳性，SICTT判定禽阳性，确定为阳性（双阳性）；1 头牛SICTT 判定为可疑，IFN-γ-ELISA 判定为禽阳性，确定为阳性（双阳性）；1 头牛SICTT 判定为可疑，IFN-γ-ELISA 判定均为阴性，判定为阳性；2 头牛SICTT 判定为阴性，IFN-γ-ELISA 判定均为阴性，确定为阴性；5 头牛 SICTT 判定为阴性，IFN-γ-ELISA 判定为牛阳性，确定为阳性；1 头牛SICTT 判定为阴性，IFN-γ-ELISA 判定为禽阳性，确定为阴性（禽阳性）。综合判定，确定牛型结核阳性牛100 头，阴性3 头（禽型1 头）。

表5 TST 判定为阳性牛

2）TST 判定为可疑牛的分析。如表6 所示，TST判定为可疑的牛共计19 头，其中SICTT 判定可疑、IFN-γ-ELISA 判定牛型阳性牛4 头，确定为阳性；SICTT 判定可疑、IFN-γ-ELISA 判定均为阴性牛7头，确定为阴性；SICTT 判定可疑、IFN-γ-ELISA 判定为禽型阳性牛3 头，确定为阴性（禽型）；SICTT 判定阴性、IFN-γ-ELISA 判定为牛型阳性牛2 头，确定为阳性；SICTT 和IFN-γ-ELISA 判定均为阴性牛3 头，确定为阴性。综合判定，牛型结核阳性牛6头，阴性13 头（其中禽型3 头）。

表6 TST 判定为可疑牛

3）TST 判定为阴性牛的分析。如表7 所示，TST判定为阴性的牛共计178 头。其中，SICTT、IFN-γ-ELISA 判定均为可疑的牛61 头，确定为阴性；SICTT 阴性、IFN-γ-ELISA 判定为禽阳性牛15头，确定为阴性（禽型）；SICTT 判定阴性、IFN-γ-ELISA 判定为牛型阳性牛99 头，确定为阳性；SICTT 判定可疑、IFN-γ-ELISA 判定为牛型阳性牛3 头，确定为阳性。综合判定，牛型结核阳性牛102 头，阴性76 头（其中禽型15 头）。

4）综合判定结果。综上所述，检测的300 头牛共确定牛型结核阳性牛208 头（其中20 头双阳），阴性92 头（其中禽型19 头）。牛型结核阳性率为69.33%，禽型结核阳性率为6.33%，二者混合感染率为6.66%。

3 讨 论

本研究同时应用TST、SICTT 和IFN-γ-ELISA 3 种不同的检测方法对试验牛场进行牛结核筛查，综合对比判定结果表明，试验牛群结核病感染率达69.33%（208/300），感染类型既有牛型结核分枝杆菌感染，又有禽结核分枝杆菌感染，牛型结核阳性率、禽型结核阳性率、二者混合感染率分别为69.33%、6.33%、6.66%。

3 种方法检测均为阳性的牛有40 头，均为阴性的61 头，总符合率仅为33.67%，说明每种检测方法各有优缺点。TST 和SICTT 相比，阳性符合率为94.89%，符合程度较高，说明在本牛场的检疫中其敏感性和特异性相差不大。 TST、SICTT 与IFN-γ-ELISA 相比，阳性符合率分别为31.16%和51.00%，阳性符合率较低。这是由于迟发型变态反应的滞后效应和人为误差造成出现假阴性结果，致使其敏感性降低[6]。SICTT 虽然在TST 基础上可有效排除部分因感染禽结核引起的假阳性，相对提高特异性，但敏感性仍不高。这与近年来国外多数研究结果相一致[7-8]。IFN-γ-ELISA 的敏感性和特异性均较高，操作简单、快速，结果客观、感染早期牛也可检出；缺点是试剂成本较高，每份样品50～100 元。

4 结 论

综合分析，对于牛分枝杆菌感染率较高且有其他病原感染的牛群，可采用成本较低的TST 初筛，然后采用IFN-γ-ELISA 复检以排除部分假阳性。鉴于IFN-γ-ELISA 可检出早期感染牛，对于实施结核病净化的牛场，按上述程序经过几轮普检后，可直接采用IFN-γ-ELISA 的方法进行检测。