1例猪繁殖与呼吸综合征诊断及基因序列分析

童洪生

福建省建宁县动物疫病预防控制中心，福建建宁354500

猪繁殖与呼吸综合征（porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是一种由猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）引起的传染病。PRRSV 属于动脉炎病毒科成员，是一种有囊膜、单股正链RNA病毒，猪被PRRSV 感染后耳部出现发紫发绀等症状，故被广泛称作蓝耳病（blue ear disease）[1]。母猪感染PRRSV 后出现免疫抑制以及持续感染，临床表现为发热与食欲降低、反复不孕、流产等，哺乳仔猪或保育猪易继发如猪链球菌病、附红细胞体、猪喘气病、猪副嗜血杆菌病、猪肺疫、猪传染性胸膜肺炎等疾病，给生猪养殖带来了很大的风险挑战。为尽快解决疑似PRRS 病例诊断技术水平，本研究着重开展了血清学和分子生物学诊断与基因序列分析，以期在临床上对PRRS 的诊断、预防和控制提供参考。

1 材料与方法

1.1 材 料

1）发病背景。福建省三明市某规模化的自繁自养场存栏母猪800 头，哺乳仔猪21 日龄断奶。2019年5 月，出现母猪流产、产床弱仔比例增多等现象，根据临床症状怀疑是PRRS。蓝耳免疫程序：母猪使用猪繁殖与呼吸道综合征疫苗（天津株）1 头份/次，1 年免疫4 次；小猪在14 日龄肌注猪繁殖与呼吸道综合征疫苗（天津株）1 头份/次。

2）样品。血清以及胎衣、扁桃体、肺等组织采集自上述规模场猪只。

3）仪器。Infinite F50 酶标仪，TECAN；MA-Smart实时荧光定量PCR，雅睿生物；TOM-XB100 自动洗板机，上海托莫斯；离心机，美国BECKMAN；全自动核酸提取仪，洛阳爱森生物。

1.2 方 法

1）PRRS 抗体检测。采样和检测方案：抽取健康母猪、有泪斑或出血点的母猪、近期流产的母猪各7头，产床上正常的仔猪、产床上病弱猪、断奶7 d 后弱猪、断奶7 d 后正常猪、断奶30 d 弱猪、断奶60 d弱猪各5 头，通过前腔静脉采血收集血清，检测PRRS 抗体。采用IDEXX 猪繁殖与呼吸综合征抗体检测试剂盒检测PRRS 抗体，具体步骤按猪繁殖与呼吸综合征病毒ELISA 抗体检测试剂盒使用说明书操作。结果判定：S/P＜0.4 为阴性，S/P≥0.4 为阳性。

2）PRRS 荧光定量PCR 检测。用病毒DNA/RNA 提取试剂盒按照使用说明书提取4 头流产胎儿的扁桃体和肺以及健康母猪、有泪斑或出血点的母猪、近期流产的母猪、产床正常的仔猪、产床上病弱猪、断奶7 d 后弱猪、断奶7 d 后正常猪、断奶30 d 弱猪、断奶60 d 弱猪血清中的繁殖与呼吸综合征病毒RNA。使用猪繁殖与呼吸综合征病毒荧光PCR试剂盒检测PRRSV 核酸，具体步骤按猪繁殖与呼吸综合征病毒荧光PCR 试剂盒使用说明书操作。判定标准：阳性结果扩增曲线在FAM 检测通道有扩增曲线且Ct 值≤38，阴性结果扩增曲线在FAM检测通道无扩增曲线且Ct 值＞38。

3）测序。将经PCR 鉴定PRRSV 病毒核酸为阳性的样品的扩增产物送往福州擎科生物技术有限公司进行测序。

4）序列分析。登录GenBank，使用DNAstar 软件对发表于GenBank 中18 株PRRSV 毒株的基因序列进行同源性分析，并利用MEGA4.0 制作演变进化树。

图1 血清学结果

表1 不同临床表现的母猪和流产胎儿的荧光PCR 检测结果

2 结果与分析

2.1 不同临床表现母猪的检测结果

从血清学结果可知（图1），健康母猪、有泪斑或出血点的母猪、近期流产的母猪的抗体水平差异并不明显。分子生物学结果显示（表1），正常母猪血液、流产母猪血液和4 头流产胎儿的组织内均未检测出PRRSV 核酸，而有泪斑或出血点的母猪血液检测出PRRSV 核酸，推断此次流产可能不是由PRRS 导致，而临床表现为泪斑或出血点母猪与PRRSV 感染存在一定的关联性。

2.2 不同阶段仔猪的检测结果

从血清学结果可知（图2），产床正常的仔猪、产床上病弱猪、断奶7 d 后正常猪、断奶7 d 后弱猪、断奶30 d 弱猪、断奶60 d 弱猪都处于一个较高的抗体水平，5 头断奶7 d 后正常猪中有3 头抗体为阴性，而断奶7 d 后的弱猪抗体为阳性且抗体水平显著高于断奶7 d 后正常猪，初步推测可能由于PRRSV 的感染而导致仔猪病弱。结合分子生物学结果（表2），产床上病弱猪、断奶7 d 后弱猪、断奶30 d 弱猪、断奶60 d 弱猪的血液中均检测到PRRSV 核酸，加之产床上正常猪的分子生物学检测结果为阴性，进一步说明病弱仔猪与繁殖与呼吸综合征病毒感染有很强的相关性。

2.3 序列分析结果

通过测序发现检测的毒株与GenBank 中18 株PRRSV 毒株的同源性在63.9%～97.2%（图3 和图4）， 其 与 15LY02-FJ、GD、HEB1、CH-1a-1996、HUN4、JXA1-2006、TJ、2015JL-102、HENZK-1 毒株的同源性＞90%；与2015JL-102、HENZK-1、JXA1-2006 的同源性最为接近。

图2 不同阶段的正常仔猪和病弱仔猪抗体检测结果

表2 不同阶段的正常仔猪和病弱仔猪荧光PCR 检测结果

图3 检测毒株与18 株PRRSV 毒株同源性比对结果

图4 检测毒株与18 株PRRSV 毒株遗传进化树分析

3 讨 论

1）PRRS 是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）引发的病毒性传染病，临床以妊娠母猪流产、死胎、木乃伊胎、弱仔等繁殖障碍，仔猪的呼吸道症状和高死亡率为特征；猪群感染该病后容易导致免疫抑制而继发其他疾病，是近年来严重危害国内外养猪业的重大猪传染病之一[2]。

2）该病的诊断常采用病毒分离鉴定、病原检测、血清抗体检测以及分子生物学检测[3]等方法，对这起疑似病例采用血清抗体检测以及分子生物学检测进行诊断，结果可知，流产母猪PRRS 抗体与健康猪群并没很大区别，PRRSV 核酸也呈阴性，推断此次流产可能与PRRS 无直接联系，建议考虑饲养管理方面或者可筛查衣原体、伪狂犬等疾病。

3）疑似病例中5 头断奶7 d 的健康猪中有3 头的PRRS 抗体呈现阴性，2 头PRRS 抗体呈现阳性，同时5 头的混合血样PRRSV 核酸呈阳性，推测可能是2 头阳性猪已被PRRSV 感染，还未表现出临床症状；同阶段的病猪变得病弱，说明断奶7 d 的健康猪群正在面临PRRSV 的威胁。

4）研究发现，PRRSV 持续不断的演化而导致其毒力增强与难以针对单一不变的基因型免疫，这些都归咎于PRRSV 是RNA 病毒。PRRSV 的基因组全长约15 kb，至少编码10 个ORFs，其中ORF5基因编码一种分子质量在15～25 kμ 的跨膜糖基化蛋白（GP5 蛋白）[2]，并且ORF5基因被学者们认为是分子进化与分析遗传变异的关键靶标。本文通过测序比对致病毒株与其他18 株PRRSV 毒株的ORF5基因，发现2015JL-102、HENZK-1、JXA1-2006 的同源性最为接近[4]，HENZK-1 是由HP-PRRSV 疫苗株JXA1-R 演化而来。本病无特效药物疗法，免疫是预防疫病发生的有效手段，建议该场更换疫苗株JXA1-R 进行免疫；同时制定合理的免疫程序，并定期开展抗体水平监测和病原学监测。