超高效液相色谱串联质谱法检测貉子肉中氯霉素、氟甲砜霉素的残留量

赵雅楠 闫玉杰 杨赵伟 马珊珊

河北省秦皇岛市农产品质量安全监督检验中心,河北秦皇岛066004

氯霉素类药物（Chloramphenicols，CAPs）主要包括氯霉素（Chloramphenicol，CAP）、甲砜霉素（Thiamphnicol，TAP）和氟甲砜霉素（Florfenicol，FF），又称为酰胺醇类，属于广谱抗生素，对革兰氏阳性菌和阴性菌均有抑制作用，对家禽、家畜、水产品及蜂蜜制品传染病的控制和治疗具有重要作用。研究发现，氯霉素可抑制骨髓细胞内蛋白质的合成，对人类和动物的骨髓细胞和肝细胞具有毒性作用，不仅可引起细胞减少性贫血、血小板减少和再生障碍性贫血，还可导致严重的胃肠道反应、二重感染、外周神经炎、灰婴综合征等，长期微量摄入氯霉素不仅使沙门氏菌、大肠杆菌等产生耐药性，而且还会导致机体正常菌群失调，使人们易患各种疾病。氟甲砜霉素的抗菌谱与氯霉素相似，但其抗菌活性优于氯霉素，对大肠杆菌、沙门氏菌、克雷伯氏杆菌等有效，但其具有胚胎毒性[1-2]。随着人们生活水平的提高，动物性食品的食用安全越来越受关注。为保障动物源食品的安全，确保该类药物不对人类健康带来威胁，世界各国都对其做出了严格规定，严禁氯霉素在食用动物上使用，我国农业部235 号公告中将氯霉素列为禁用药物，规定氟甲砜霉素的在其他动物组织中最高残留限量为100 μg/kg。

动物性食品中氯霉素残留超标主要是违法添加和环境污染所致。现代养殖业大部分都采取集约化养殖，饲养密度过高，从而导致多种疾病的传播。氯霉素虽然属于禁用药物，但由于其价格低、见效快，其违规使用现象仍然存在于畜禽养殖过程中；其次，由于饲喂的饲料、饮水等受到污染或是人为因素导致的药物在饲料中残留；此外部分养殖人员对相关法律法规和兽药残留危害认识不够，用药过量或休药期内屠宰也会造成动物性食品中氯霉素的残留。

目前，关于氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素残留的检测方法包括微生物法、酶联免疫法、气相色谱法、液相色谱法、气相色谱-质谱法、液相色谱-质谱法等，但残留检测对象主要集中于蜂蜜、水产品以及肉、蛋、乳制品等[3]。本研究建立了一种针对貉子肉中氯霉素、氟甲砜霉素的超高效液相色谱串联质谱的检测方法，简化了GB/T22338—2008 的前处理方法，优化了液相和质谱方法，能有效消除样品在提取过程中的损失，缩短检测时间，减少有机试剂消耗，为评估氯霉素、氟甲砜霉素在食用类貉子肉中残留提供检测参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1）试验样品。从河北省秦皇岛市昌黎县下属的10 个乡镇选取各60 份屠宰取皮后的貉子肉，放于塑封袋里包好，-80 ℃冷冻保存。采样地点和样品编号见表1。

表1 貉肉采样地点和样品编号

2）试验仪器。超高效液相色谱串联质谱仪UPLC XEVOTQ，Waters；CP214 电子天平，上海奥豪斯仪器有限公司；SB-5200DT 数控超声波清洗器，宁波新芝生物科技股份有限公司；TGL-20M 台式高速冷冻离心机，湖南赫西仪器装备有限公司；SPT-16 氮空吹扫浓缩仪，北京斯珀特科技有限公司；GX274 固相萃取仪，法国吉尔森公司；固相萃取柱，200 mg，3 mL，Waters。

3）试剂。标准品：氯霉素，99.5%，中国兽医药品监察所；氯霉素D5内标物，100 ng/mL，德国；氟甲砜霉素，100 μg/mL，农业农村部环境保护科研检测所。乙腈，色谱纯，Fisher；正己烷，色谱纯，Fisher；丙酮，色谱纯，Fisher；试验用水为一级水。

1.2 试验方法

1）样品前处理。从河北省秦皇岛市昌黎县10 个乡镇采取的貉子腿中随机选取60 个样品进行检测。称取5.0 g 试样于50 mL 离心管中，加入50 μL 1 μg/mL 氯霉素D5内标工作液和25 mL 乙腈，超声提取10 min，8 000 r/min 离心10 min，吸取10 mL 上清液于另一个50 mL 离心管中，加入10 mL乙腈饱和正己烷，充分摇匀，静置5 min，吸取5 mL乙腈层于10 mL 离心管中，氮气吹干，加5 mL 的丙酮-正己烷（体积比1∶9）溶解。

丙酮-正己烷（体积比1∶9）溶液5 mL 淋洗小柱，弃去淋洗液，加入残渣溶解液，弃去流出液，加入5 mL 丙酮-正己烷（体积比6∶4）溶液，收集洗脱液，氮气吹干，加1 mL 的20%乙腈溶液，过0.22 μm 滤膜后上机测定，同时制备空白基质液和阳性添加样品，采用与样品相同处理方法。

2）色谱条件。色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18（1.7 μm，2.1 mm×100 mm）；柱温：30 ℃；进样量：10 μL；流动相：乙腈和一级水，洗脱程序见表2。

表2 梯度洗脱程序

3）质谱条件。电喷雾离子源（ESI-）；离子源温度：150 ℃；检测方式：多反应监测；毛细管电压：2.60 kV；去溶剂气：高纯氮气；去溶剂气流量：1 000 L/h；去溶剂气温度：500 ℃；碰撞气：氩气；锥孔气：高纯氮气；锥孔气流量：50 L/h；氯霉素、氟甲砜霉素及氯霉素内标物的质谱参数表见表3。

2 结果与分析

2.1 色谱条件的优化

通过反复试验梯度洗脱条件，实现了3 种物质的分离，排除干扰，在5 min 之内完成对药物的检测（表2）。本试验优化的色谱条件，在流动相中不添加乙酸铵，也能获得良好的峰形及优异的检测灵敏度。

表3 质谱采集参数表

试验发现采用不同的溶剂作为标准稀释液或样品处理后的复溶溶液会对质谱响应及色谱峰形产生显著影响。比例过高的有机溶剂能明显增强质谱响应，但同时也会造成部分化合物的色谱峰形坍塌。经多次试验，确定以20%乙腈溶液作为样品处理后复溶及标准溶液配制用溶液，可获得对称、尖锐的峰形和良好的质谱响应。

2.2 质谱条件的优化

氯霉素类化合物因含有酚羟基，而适合在ESI源的负离子模式下离子化。在负离子化模式下，分别将3 种物质以0.5 μg/mL 的标准溶液注入质谱仪进行质谱参数的优化。先通过母离子全扫描确定化合物的分子离子峰，以此作为母离子，再对离子源参数进行优化，比较不同锥孔电压下的母离子强度，确定母离子达到最大响应值时的最佳锥孔电压值。然后对母离子作子离子全扫描，确定每种氯霉素类药物的碎片离子信息，并选择离子丰度较高、干扰较小的2 个特征碎片子离子作为各个目标化合物的定性离子，同时对碰撞能量进行优化，确定碎片离子有最大响应强度时的最佳碰撞电压值，最后得到该化合物的2 个MRM 离子对及相应的质谱参数,这与前人所操作类似试验得到的结果近似[4-6]。根据电离机制，以利于化合物去质子化的乙腈作为有机相，可改善该类化合物在负离子模式下的离子化效率。试验验表明，与标准GB/T 22338—2008 中以乙酸铵、乙腈和水为流动相比较，单纯以水和乙腈为流动相时，氯霉素类化合物的响应无明显差异，因此，本方法选择乙腈和水为流动相，以减少有机盐对色谱柱的损伤。

2.3 提取过程的优化

预试验采用标准GB/T 22338—2008 的前处理方法，添加检测回收率达到58%，分析回收率偏低的原因，可能主要由于试验的前处理过程中分液漏斗使用过多及旋转蒸发的溶液量较大造成的损耗。为提高样品回收率，通过借鉴其他提取方法，经过数次改进，添加阳性样品的回收率有了明显的提高趋势，达到68%～115%。

本试验使用的化合物属于弱极性化合物，常用的提取溶剂涉及甲醇、乙腈、乙酸乙酯等，本试验只考察常用提取溶剂乙腈、乙酸乙酯的提取效果。试验发现乙腈与乙酸乙酯的提取回收率相当；但用乙酸乙酯提取的溶剂颜色略深，说明溶液中带出了一些弱极性基质成分，这将增加后续净化的难度；乙腈在有效提取目标物的同时具有沉淀蛋白的作用，且带出的弱极性成分大大减少，因而选用乙腈作为本研究的提取溶剂。

2.4 线性关系

准确移取适量标准溶液，制成0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0 ng/mL 的6 个质量浓度水平的混合标准工作液，其中内标物质量浓度为10 ng/mL，按优化好的条件进行测定，得线性回归方程，其相关系数均在0.999 以上，表明各化合物在相应浓度范围内呈良好的线性关系。

2.5 检测限与定量限

将加标浓度逐级稀释添加于空白样品中测定信噪比，最终以3 倍信噪比确定该方法的检测限，以10 倍信噪比确定该方法定量限，从而得出氯霉素和氟甲砜霉素的检测限为0.1 μg/kg，定量限为0.3 μg/kg。

2.6 回收率和精密度

向空白样品中添加0.5、1.0、2.0 μg/kg 3 个浓度水平的混合标准溶液，每个浓度水平做4 个平行，试验结果表明，氯霉素平均回收率在68%～99%；氟甲砜霉素平均回收率在70%～115%，测定结果相对偏差均小于10%，相应MRM 图见图1。

2.7 检测结果

60 个被测样品中，除了H83 检出氯霉素含量（0.105 μg/kg）超过最低检测限0.1 μg/kg 外，其余样品均未检出氯霉素和氟甲砜霉素，占被检测样品的1.5%。

3 讨 论

图1 貉子肉中氯霉素、氟甲砜霉素和氯霉素内标物D5 的MRM 图

本研究建立了一种采用超高效液相色谱串联质谱仪对貉子肉中氯霉素、氟甲砜霉素的残留量进行定性和定量检测的方法。以氘代氯霉素（D5-CAP）为内标，样品经乙腈提取，乙腈饱和正己烷除脂，固相萃取柱净化后，采用多反应监测（MRM）负离子模式，对貉子肉中氯霉素、氟甲砜霉素的残留量进行定量检测。结果表明，2 种药物在0.1～5.0 μg/mL 范围内均呈现良好线性关系，相关系数 均大于0.999。样品中氯霉素和氟甲砜霉素的检测限为0.1 μg/kg，定量限为0.3 μg/kg，本方法在0.5～2.0 μg/kg 添加范围内药物回收率为68%～115%，其相对偏差均小于10%。该方法具有简便快捷、准确度高、精密度好、损耗少和定量更准确等优点。试验还对河北省秦皇岛市昌黎县10 个乡镇貉子肉中氯霉素和氟甲砜霉素残留数据进行分析，了解昌黎县貉子肉中氯霉素类药物的残留状况，评估食用貉子肉内残留，并对市场提出潜在风险预警。