禽流感病毒H7亚型竞争ELISA抗体检测方法的建立

范俊青 魏燕鸣 邹 忠 李 冉 孙小美 金梅林,

1.武汉科前生物股份有限公司，武汉 430070；2.华中农业大学动物医学院，武汉 430070

禽流感是由禽流感病毒（Avian Influenza Virus，AIV）引起的一种急性呼吸道传染病，具有传染性强、传播速度快、抗原易变异等特点[1]。自2013年春天在长三角地区出现新型H7N9病毒疫情以来，冬春季节交替时人感染H7N9病毒的病例每年都有发生[2-3]。该病毒在我国活禽交易市场及养禽农场的感染范围不断扩大，2017年3-6月，在湖南、河北、河南、天津、山西、黑龙江和内蒙古等省份均有家禽感染高致病性H7N9病毒的报道。自疫情暴发以来，约6万羽家禽感染，30万羽家禽遭扑杀。多家兽医机构监测结果均表明，我国H7N9亚型流感病毒的养殖场阳性率和个体阳性率在总体上均呈现逐年上升趋势，对家禽养殖业和公共卫生安全造成了严重威胁[4-5]。国家禽流感参考实验室采用反向遗传技术，研制出重组禽流感病毒（H5+H7）二价灭活疫苗（H5N1 Re-8株+H7N9 H7-Re-1株），通过深入调查研究和专家论证，农业部决定先行在广东省和广西壮族自治区对该疫苗进行试点性应用，再进一步在全国范围内进行推广，为有效控制H7N9病毒的蔓延奠定了基础。常规检测禽流感病毒抗体的方法是血凝抑制（HI）试验，HI试验对操作人员的专业素质要求较高，过程繁琐，对结果判定也有较强的主观性。因此，研制一种禽流感H7亚型抗体检测方法对评价疫苗免疫效果和及时监测鸡群抗体水平显得极为重要。

1 材料与方法

1.1 细胞与试验动物

多发性骨髓瘤细胞（SP2/0）来源于农业微生物学国家重点实验室，由武汉科前生物股份有限公司保存备用，BALB/c小鼠购于湖北省实验动物研究中心。

1.2 主要试剂与试剂盒

RPMI-1640 购 自 HyClone，50%PEG1450（P7181）、辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG、50×HAT（A：氨基蝶呤）、100×HT（H：次黄嘌呤和 T：胸腺嘧啶核苷）、弗氏不完全佐剂、弗氏完全佐剂、鼠类单克隆抗体亚类鉴定试剂盒购自Sigma公司，青链霉素（100×）、胎牛血清购自Gibco公司。禽流感病毒H7亚型血凝抑制试验抗原，加入2 mL pH值7.4的PBS溶解作为免疫原。

1.3 禽流感病毒H7亚型单克隆抗体的制备

1）按照常规方法进行动物免疫。三免后14 d，尾静脉采血，间接ELISA测定血清效价。选择效价最高的小鼠进行加强免疫。免疫后第3天，进行细胞融合。

2）按照常规方法进行细胞融合。采用间接ELISA对杂交瘤细胞上清进行筛选。阳性孔再经过3次有限稀释法进行亚克隆，待阳性率达到100%时扩大培养，用于制备腹水，并保存于液氮。参照文献进行腹水的制备，待小鼠腹部膨大后抽取腹水，离心取上清[6]。

1.4 禽流感病毒H7亚型抗体竞争ELISA检测方法的建立

1）竞争ELISA抗体检测方法的初步建立。将获得的具有竞争效果的单抗纯化酶标后，初步建立竞争ELISA抗体检测方法。

2）特异性试验。用试制试剂盒分别对5份禽流感病毒H7亚型抗体阴性血清、禽流感病毒H5亚型（AIV-H5）阳性血清、禽流感病毒 H9亚型（AIV-H9）阳性血清、新城疫病毒（NDV）阳性血清、传染性支气管炎病毒（IBV）阳性血清、传染性法氏囊病毒（IBDV）阳性血清进行检测，根据检测结果评价其特异性。

3）敏感性试验。选取6份阳性血清和阳性参考血清从2倍开始倍比稀释至64倍，分别用3批禽流感病毒H7亚型竞争ELISA抗体检测试剂盒和HI试验2种方法检测。当待检血清的HI抗体效价稀释至4log2时（HI试验判定标准：当HI抗体效价≥4log2，判为阳性；HI抗体效价＜4log2，判为阴性），对应试制试剂盒检测的PI值应≥40%，以此来评价试制试剂盒的敏感性。

4）与HI试验符合率比较试验。与HI试验同时检测150份样品，比较2种方法检测结果的符合率。

2 结果与分析

2.1 单克隆抗体的筛选

对阳性杂交瘤细胞株所分泌的上清做竞争效果的筛选，其中阳性血清的OD450nm值用“P”表示，阴性血清细胞上清的OD450nm值用“N”表示，当N/P值越大时，细胞上清的竞争效果越好。试验结果表明，1H11细胞株所对应的抗体N/P值最大，竞争效果最佳（表1）。

表1 杂交瘤细胞株培养上清竞争效果评价（OD450 nm值）

2.2 竞争ELISA抗体检测方法的初步建立

使用方阵滴定试验摸索包被抗原和酶标抗体的稀释滴度。将抗原按 1∶400、1∶800、1∶1 000、1∶1 200、1∶1 500、1∶2 000、1∶2 500、1∶3 000 进行稀释，分别加入到酶标板的第1～8行，每个稀释度加1行，每孔100 μL。将酶标记抗体按1∶400、1∶600、1∶800、1∶1 000、1∶1 200、1∶1 500 进行稀释，分别加入酶标板的第1～6列/7～12列，每个稀释度加1列，每列100 μL。按照竞争ELISA的常规步骤进行操作[7]，方阵滴定结果见表2。当抗原1∶1 000稀释、酶标记物1∶1 000稀释时，阳性对照PI值最大，因此，选择抗原最佳包被浓度为1∶1 000稀释（每孔抗原包被量含量为2 μg/mL）、酶标记物最佳稀释倍数为1∶1 000，其N/P值最大（表3）。

表2 方阵滴定结果（OD450 nm值）

表3 方阵滴定的N/P值

2.3 特异性试验

用试制的禽流感病毒H7亚型竞争ELISA抗体检测试剂盒检测5份禽流感病毒H7亚型抗体阴性血清，结果均为阴性（表4）；检测常见禽病的阳性血清，检测结果均为阴性（表5），说明该试剂盒与其他常见禽病的阳性血清均无血清学交叉反应。以上结果表明，试制的禽流感病毒H7亚型竞争ELISA抗体检测试剂盒具有良好的特异性，可用于血清中禽流感病毒H7亚型抗体检测。

表4 5份禽流感病毒H7亚型抗体阴性血清检测结果

表5 常见禽病的阳性血清检测结果

2.4 敏感性试验

用试制的3批禽流感病毒H7亚型竞争ELISA抗体检测试剂盒和HI试验2种方法检测7份血清。将阳性血清6份和阳性参考血清从2倍开始倍比稀释至64倍，用HI试验和试制的试剂盒2种方法分别检测血清效价，结果基本一致。说明试制的禽流感病毒H7亚型竞争ELISA抗体检测试剂盒具有良好的敏感性，可以用来检测禽流感病毒H7亚型抗体（表6）。

2.5 与HI试验符合率比较试验

将试制的禽流感病毒H7亚型竞争ELISA抗体检测试剂盒与HI试验同时检测鸡血清150份，禽流感病毒H7亚型竞争ELISA抗体检测试剂盒检测为阳性28份，阴性122份，HI试验检测为阳性27份，阴性123份。试制的试剂盒与血凝抑制试验相比，符合率为99.3%（表7）。试制的试剂盒与血凝抑制试验的符合率较高，由此也证实了所研制的试剂盒在检测鸡血清中禽流感病毒H7亚型抗体的可靠性。

3 讨论

目前，关于H7亚型禽流感病毒单克隆抗体的应用相继有报道，主要是在胶体金试纸条、间接免疫荧光、免疫组化等方面的应用[8-9]。在本研究中，制备了12株特异性针对H7亚型禽流感病毒的单克隆抗体，并通过竞争ELISA方法筛选1株具有较好血凝抑制作用的1H11细胞株，制备并纯化得到单克隆抗体，建立了1种应用于评价抗H7亚型禽流感病毒血清抗体水平的竞争ELISA抗体检测方法，试制了试剂盒。用试制的禽流感病毒H7亚型竞争ELISA抗体检测试剂盒检测150份血清样品，并且与HI试验进行比较，符合率为99.3%；选取6份禽流感病毒H7亚型HI抗体效价≥9log2和阳性参考血清同时进行敏感性检测，结果表明试制试剂盒与HI试验敏感性一致；检测禽流感病毒H5亚型（AIV-H5）、禽流感病毒 H9亚型（AIV-H9）、新城疫病毒（NDV）、传染性法氏囊病毒（IBDV）、传染性支气管炎病毒（IBV）阳性血清均为阴性，检测已知无禽流感病毒H7亚型感染的血清全部为阴性，证明试剂盒特异性良好。

该方法操作简便快捷，可批量操作，大样本检测鸡群抗体水平，为H7禽流感病毒的免疫水平监测提供依据。在我国，高致病性禽流感病毒的免疫防控策略是通过灭活疫苗的免疫维持鸡群中高抗体水平，鸡群中抗体水平的检测主要依赖于血凝抑制试验，对试验者专业要求高，且工作量大，不利于大规模开展抗体监测。竞争ELISA抗体检测方法的使用可很好地替代血凝抑制试验，操作简便快捷，适用于大规模进行田间检测H7亚型禽流感病毒的抗体水平，对鸡群及时、精准的免疫提供指导意义。

表6 试制试剂盒与HI试验敏感性比较

表7 与HI试验符合率结果