基于ITS序列PCR-RFLP鉴别北柴胡混伪品藏柴胡*

赖晶 倪琳 蔺瑞丽 靳婉君 刘富强 宋平顺 马萧 滕宝霞

(甘肃省药品检验研究院/国家中药材及饮片质量控制重点实验室,甘肃 兰州 730013)

《中华人民共和国药典》2020年版收载的柴胡为伞形科植物柴胡(BupleurumchinenseDC.)和狭叶柴胡(BupleurumscorzonerifoliumWild.)的干燥根,根据性状不同,前者习称“北柴胡”,后者习称“南柴胡”[1]。柴胡作为大宗中药材之一,含柴胡的中成药的品种也有很多,如小柴胡颗粒、柴胡疏肝丸、柴胡滴丸等,不仅具解表散热、疏肝和胃等功效,而且据文献报道,加味小柴胡汤对治疗肺部多重耐药菌感染有明显效果[2]。当前,随着不同地方引进栽培,柴胡属出现很多变种。藏柴胡作为柴胡属变种之一,来源于伞形科植物窄竹叶柴胡BupleurummarginatumWall.ex DC.var.stenophyllum(Wolf) Shan et Y.Li的干燥根,主产于云南,四川、贵州、西藏等部分地区[3]。我国贵州省药材标准中又以“竹叶柴胡”的名称收载[4]。由于北柴胡野生资源短缺和价格高,药材市场出现了以藏柴胡充当正品北柴胡的现象,影响药效和安全问题,因此建立基源鉴定方法十分必要。

《中国药典》和《日本药局方》通过柴胡皂苷a和柴胡皂苷d的总含量控制柴胡质量,《欧洲药典》《英国药典》《中药材标准》和《韩国药典》以单一指标成分柴胡皂苷a进行质量控制[5]。有文献报道利用HPLC和比色法对柴胡中柴胡皂苷a(SSa)和柴胡皂苷d(SSd)及总黄酮的含量来进行柴胡质量评价[6]。SSd是SSa的差向异构体,SSd除了具有与SSa相似的抗炎[7]、抗肿瘤[8]和免疫调节[9]的药理作用,SSd还有特定的药理作用,如抗过敏[10]和抗凋亡[11]。现报道的文献一般利用柴胡皂苷来鉴别柴胡药材真伪,仅靠单一指标对鉴别真伪有很大的局限性,不能更全面控制柴胡质量。

PCR-RFLP是利用特定的限制性内切酶识别特异性序列将PCR扩增产物消化切割成大小不同的DNA片段,可直接用琼脂糖凝胶电泳分辨DNA条带大小及多态性的方法。现已有文献报道关于PCR-RFLP鉴定中药材的真伪鉴别,如大黄[12]、木通[13]、泽泻[14]、川贝母[15]、人参[16]。PCR-RFLP方法不仅可以用于物种鉴定,还可以用于不同产地的地理鉴别[17]。本试验旨在筛选藏柴胡的限制性内切酶,并设计引物,对PCR-RFLP方法优化和考查,从而建立适用于快速、稳定鉴别北柴胡混伪品藏柴胡的方法。

1 仪器与材料

1.1仪器 VeritiTM96-Well型PCR仪;Legend Micro 21R型高速冷冻离心机;Nano Drop2000型微量核酸定量仪(美国赛默飞世尔科技公司);Sub Cell®GT型电泳仪(美国伯乐公司);Geldoc-It2 315型凝胶成像系统(美国UVP公司)。

1.2试剂 Plant Genomic DNA Kit 200 preps植物基因组DNA提取试剂盒,2×Taq PCR MasterMix,50×TAE[天根生化科技(北京)有限公司],Prime STAR HS Premix,DL500 DNA Marker(TAKARA),Ase Ⅰ限制性内切酶(美国NEB公司),2×Taq PCR StarMix(北京康润诚业生物科技有限公司),琼脂糖(美国Invitrogen公司),GelRed (美国Biotium公司)。

1.3药材 北柴胡对照药材(批号:120992-201509)购于中国食品药品检定研究院。收集了9批北柴胡和21批藏柴胡的干燥根,经甘肃省药品检验研究院宋平顺检验师和马萧主任药师鉴定,具体信息见表1。

2 方法

2.1酶切位点选择及PCR-RFLP引物设计 将GenBank数据库中的北柴胡和藏柴胡的ITS序列利用DNAMAN软件比对,北柴胡和藏柴胡的ITS序列存在多个SNP位点变异,藏柴胡有Ase Ⅰ限制性内切酶酶切位点(AT^TAAT),北柴胡无此酶切位点。通过Primer Premier 5.0软件设计内含此酶切位点的鉴别引物BmF-BmR(见表2),送华大基因(北京)有限公司合成。

表2 PCR扩增引物序列

2.2基因组DNA提取 取适量药材用75%乙醇消毒后用灭菌超纯水冲洗,晾干,粉碎,称取药材粉末约30 mg,置于1.5 mL离心管中,采用植物基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA,加入50 μL洗脱缓冲液,于-20 ℃保存备用。

2.3PCR扩增条件优化 用 1、7、9、10、13号样品对特异性鉴别引物进行PCR扩增,为获得最适特异性PCR反应条件,分别考察退火温度(58、60、62、63 ℃)、循环数(25、30、35个循环)、不同酶(2×Taq PCR StarMix、Prime STAR HS Premix)对PCR扩增的影响。

2.4酶切体系及条件考察 用 1、7、9、10、13号样品对酶切条件进行优化,分别考察酶切时间(5、10、15、30和60 min)和酶切底物(6、10和12.5 μL)。

2.5电泳 用2.5%的琼脂糖电泳检测PCR扩增产物及酶切产物,在130 V电压的条件下电泳约50 min,然后利用凝胶成像分析仪拍照。

3 结果分析

3.1不同退火温度考察 分别设置58,60,62和63 ℃ 4个退火温度进行考查。退火温度为60 ℃,扩增条带均清晰可见,无假阳性条带;温度上升至63 ℃时,不易扩增出条带。因此,为保证PCR具有良好的重复性,采60 ℃作为此方法的退火温度。结果见图1。

注:A.58 ℃;B.60 ℃;C.62 ℃;D.63 ℃;M.DL500 DNA Marker;空白.空白对照;1、7、9、10、13分别与样品信息表中的样品对应。

3.2不同循环数考察 将PCR循环数分别设置为25、30、35个循环。25、30个循环时,有清晰的扩增条带;当35个循环时,有假阳性条带出现。因此为保证扩增的稳定性及区分度,选择30个循环作为扩增循环参数。结果见图2。

注:A.25个循环;B.30个循环;C.35个循环;M.DL500 DNA Marker;空白.空白对照

3.3不同聚合酶考察 除上述方法中使用的聚合酶2×Taq PCR Mastermix外,本试验还考察了2×Taq PCR StarMix酶和Prime STAR HS Premix酶对该PCR扩增的影响。PCR反应体系为20 μL,包括2×Taq PCR Mastermix 10 μL,正反向引物0.4 μL,DNA模板1 μL,无菌水补足至20 μL;反应条件为94 ℃ 3 min,30个循环(94 ℃ 30 s,60 ℃ 20 s,72 ℃ 20 s),72 ℃ 5 min。用不同聚合酶均能扩增出单一DNA条带,说明PCR扩增条件适用于不同酶。结果见图3。

注:A.2×Taq PCR StarMix;B.Prime STAR HS Premix

3.4酶切体系及条件 考察酶切时间分别为5、10、15、30及60 min,藏柴胡均能被限制性内切酶AseⅠ酶切切割成79 bp和252 bp两条DNA条带。随着酶切反应时间的增长,藏柴胡酶切后的两条DNA条带逐渐变亮。考虑到非特异性扩增和酶切后79 bp的DNA条带不清晰引起的误判,酶切时间为1 h。结果见图4。

注:A.酶切时间为5 min;B.酶切时间为10 min;C.酶切时间为15 min;D.酶切时间为30 min;E.酶切时间为60 min

分别设置6、10、12.5 μL的PCR扩增产物梯度,酶切1 h。北柴胡不能被酶切,藏柴胡被酶切成79 bp和252 bp两条DNA条带。随着PCR产物量的增大,酶切后的两条DNA条带逐渐变亮。结果见图5。

注:A:PCR扩增产物6 μL;B:PCR扩增产物10 μL;C:PCR扩增产物12.5 μL

综上所述,酶切反应总体积20 μL,反应体系包括10×酶切缓冲液2 μL,限制性内切酶Ase Ⅰ (10 U/μL) 0.4 μL,PCR反应液10 μL,无菌超纯水7.6 μL,酶切反应在37 ℃水浴反应1 h。

3.5适用性的考察 按照上述PCR-RFLP方法对北柴胡对照药材、9份北柴胡和21份藏柴胡进行鉴别。PCR反应体系为20 μL,包括2×Taq PCR Mastermix 10 μL,正反向引物0.4 μL,DNA模板1 μL,无菌水补足至20 μL;反应条件为94 ℃ 3 min,30个循环(94 ℃ 30 s,60 ℃ 20 s,72 ℃ 20 s),72 ℃ 5 min。结果表明,北柴胡和藏柴胡均能扩增出一条331 bp的单一DNA条带(图6A)。用限制性内切酶Ase Ⅰ酶切后21份藏柴胡均被酶切成大小不同的两条条带,分别为79 bp和252 bp;而北柴胡对照药材和北柴胡药材均不能被酶切(图6B)。说明该PCR-RFLP反应方法适用于鉴别藏柴胡。

注:A:PCR扩增电泳图;B:AseⅠ 酶切电泳图。空白:空白对照;对照:北柴胡对照药材

3.6掺伪检出限考察 为考察藏柴胡特异性PCR扩增对北柴胡中掺伪藏柴胡的鉴别能力。按0%(北柴胡)、1%、3%、5%、10%、25%、50%、75%、100%(藏柴胡)比例将藏柴胡掺于北柴胡中,充分混匀即可。使用上述PCR-RFLP方法。掺有1%的藏柴胡,酶切后有很浅的条带;随着藏柴胡掺入量增加,酶切条带越来越清晰。结果见图7。

图7 北柴胡中掺假不同比例藏柴胡的PCR-RFLP电泳图

3.7不同产地掺假验证 取不同产地的北柴胡与藏柴胡,随机比例掺兑。所有样品均能扩增出一条331 bp的单一DNA条带,掺有藏柴胡的混合样均被酶切成79 bp和252 bp两条DNA条带。结果见图8。

注:空白.空白对照;对照.北柴胡对照药材;1.北柴胡(镇原)掺入藏柴胡(镇原);2.北柴胡(陇西)掺入藏柴胡(临洮);3.野生北柴胡(华亭)掺入藏柴胡(镇原);4.北柴胡(和政)掺入藏柴胡(临洮)

4 讨论

在市场中存在以藏柴胡冒充北柴胡药材或掺杂混用的现象,这严重影响药材质量、药效和用药安全。随着DNA分子鉴定技术越来越成熟,可以从基因层面解决以化学成分为主的传统鉴定带来的不足,为中药材鉴定提供更加准确、可靠的手段。ITS序列是位于核糖体DNA(rDNA)上具有高度重复,各位点间协同进化,可用于属、种的鉴定。谢晖等[18]通过对9种柴胡属植物进行ITS序列测序后同源性比对,结果发现柴胡属属内两两比对同源性均大于88%,同种植物大于99%。Lin等[19]对柴胡3个种(柴胡、高氏柴胡、阿尔泰柴胡)设计出序列特异性寡核苷酸探针(SSOP),分别和样品ITS区扩增产物杂交,通过扫描检测可鉴定不同种的柴胡。因DNA测序和DNA芯片技术制备样本时间长及程序多,该方法在日常检验中有一定的局限性。PCR-RFLP方法作为DNA鉴定的方法之一,具有简单、稳定、专属性强和反应灵敏等优势,在药用植物鉴定中发挥着关键作用。本试验以ITS序列作为分子标记,依据北柴胡和藏柴胡的种间差异,筛选藏柴胡的特异性限制性内切酶Ase Ⅰ(AT^TAAT),设计含酶切位点的引物,建立了北柴胡药材及饮片中掺伪藏柴胡的检查方法。

PCR-RFLP反应又受到PCR反应体系、反应条件以及酶切时间等的影响,其中,最重要的是退火温度、引物浓度和循环数,引物浓度与退火温度选择不好会造成非特异性扩增,出现假阳性[20]。在酶切反应时,底物浓度也会影响酶切的效果,当底物浓度过低,可能会导致酶切后的条带不清晰,可能会有一定的误判。本试验对该PCR扩增条件、不同聚合酶、酶切反应条件考察,建立了能够检测北柴胡中含1%藏柴胡掺伪检出限的PCR-RFLP方法。PCR-RFLP方法提高了目的DNA的相对特异性、灵敏度,极大程度降低了PCR的假阳性,保证鉴定结果的准确性。

在历年抽检过程中,存在掺杂非药用部位的问题[21-22]。本试验存在一定的局限性,因是从北柴胡和藏柴胡的基源出发,只能定性的鉴别北柴胡中是否掺有藏柴胡,但对于是否掺杂北柴胡非药用部位还有待于解决。但该PCR-RFLP方法依然是可用于鉴别北柴胡中掺伪藏柴胡手段之一,可供质控部门参考使用。