消饮化瘀方对慢性心力衰竭大鼠NT-proBNP及GPR35mRNA水平的影响*

王铭 马立旭 王秀萍 韩金荣 徐建虎**

(1.宁夏区域高发病中西医结合防治研究重点实验室,银川 750004;2.宁夏医科大学回医药现代化教育部重点实验室,银川 750004;3.宁夏回族自治区人民医院,银川 750002)

慢性心力衰竭(chronic heart failure,CHF)是由于体循环和肺循环瘀血从而出现心动过速、呼吸困难、下肢水肿等一系列症状[1-2],其中体循环和肺循环瘀血导致心脏缺血缺氧是CHF发生发展的关键。研究发现G蛋白偶联受体35(G protein-coupled receptor 35,GPR35)是治疗心血管疾病的新兴靶点[3],抑制GPR35可减轻心肌缺血缺氧损伤[4]。中医认为心气虚是CHF发病的根本,瘀血为发病的中心环节,水停为发病的必然结果[5-6]。《慢性心力衰竭中医诊疗专家共识》也指出痰饮和瘀血是CHF的病理因素[7]。本研究通过观察消饮化瘀方对CHF大鼠前体脑钠肽(N-terminal pro-brain natriuretic peptide,NT-proBNP)及GPR35mRNA的影响,探讨其可能作用机制。

1 仪器与材料

1.1仪器 RM2016切片机(上海徕卡仪器有限公司);酶标仪(芬兰公司);洗板机(芬兰公司);centrifuge5417R低温高速离心机(Eppendorf公司);BioPhotometer生物分光光度计(Eppendorf公司);DS-Ⅱ核酸蛋白定量仪(美国丹诺尔);CFX Connect荧光定量PCR仪(美国Bio-RAD)。

1.2试药 消饮化瘀方中所有药材均购自宁夏医科大学附属回医中医院门诊部,经宁夏医科大学药学院中药教研室检验合格;美托洛尔(批号:H32025391,阿斯利康药业有限公司);盐酸阿霉素(批号:S17092,源叶生物公司)。 苏木素染液(北京百灵威科技有限公司);伊红染液(源叶生物,R20594);NT-proBNP Elisa试剂盒(上海信裕生物科技有限公司,XYR903292);2*SYBR Mixture 荧光定量试剂盒(北京天根,Cat# FP-205-2);HiFiScriptT 快速去除基因组cDNA第一条链合成试剂盒(康为试剂,Cat# CW2582M)。

1.3实验动物 SPF级SD雄性大鼠,240～260 g,购买于宁夏医科大学动物中心,许可证号:SCXK(京)2019-0008。已通过宁夏医科大学实验动物伦理申请。

2 方法

2.1分组与造模方法 用计算机随机数字法将72只大鼠随机分为空白组和A组,A组参考文献[8-9]复制CHF模型,选用2 mg·kg-1的剂量进行腹腔注射阿霉素,每周2次,共6 w。将复制成功的CHF大鼠随机分为模型组、消饮化瘀方(简称中药)高剂量组、中药中剂量组、中药低剂量组、美托洛尔组,每组12只。

2.2药物制备及干预 按照《中国药典》制剂制备的相关要求,将消饮化瘀方制成含2 g·mL-1生药的药液。给药剂量按照成人与大鼠体表面积换算,分别给予中药高(28 g·kg-1)、中(14 g·kg-1)、低(7 g·kg-1)及美托洛尔(10 mg·kg-1)灌胃(高、中、低剂量分别相当于成人等效剂量的2倍、1倍、0.5倍),空白组和模型组灌胃给予等量的生理盐水,每日一次,连续4 w。

2.3指标检测

2.3.1HE染色观察心肌组织形态学变化 取心肌组织放入4%多聚甲醛固定,经冲水、梯度酒精脱水、透明、浸蜡、包埋等步骤后,制成切片,60 ℃烘片 2 h后进行脱蜡、梯度酒精脱水、苏木精染色、盐酸酒精分化、伊红染色、透明、封片。显微镜下观察心肌组织形态学变化并拍照。

2.3.2Elisa检测血清中NT-proBNP含量 腹主动脉采血,4000 r·min-1,离心10 min,吸取上层血清,用酶联免疫吸附法检测各组大鼠血清中NT-proBNP的水平。按照试剂盒使用说明书中操作步骤进行操作。

2.3.3Real Time PCR检测心肌组织中GPR35mRNA表达水平 用Trizol提取心肌组织中总RNA,逆转录为cDNA,并进行实时荧光定量PCR检测。将样品放入实时定量PCR扩增仪中预变形95 ℃ 15 min后,95 ℃变形10 s、退火30 s、72 ℃延伸30 s,40个循环。用GPR35mRNA基因引物和β-actin内参基因引物进行扩增。同时在60～95 ℃进行溶解曲线分析利用PCR仪绘出扩增曲线,进行结果分析。见表1。

表1 引物序列

3 结果

实验过程中,模型组死亡1只(腹水),美托洛尔组死亡4只(腹水及麻药过量),中药低剂量组死亡2只(腹水及灌胃手法操作不当),中药中剂量组死亡1只(灌胃手法操作不当),中药高剂量组死亡2只(灌胃手法操作不当)。

3.1消饮化瘀方对大鼠心肌组织形态学变化的影响 HE染色结果显示:空白组可见心肌细胞横纹清楚,排列整齐,无肌纤维断裂,胞质均匀,表明心肌为正常结构;模型组可见心肌细胞排列紊乱,心肌间质水肿,肌纤维断裂,伴有大量的慢性炎症细胞浸润,出现明显的心肌纤维化特征;各治疗组与模型组相比,心肌细胞排列变整齐,无心肌纤维断裂。见图1。

3.2消饮化瘀方对大鼠血清NT-proBNP含量的影响 与空白组相比,模型组NT-proBNP含量明显升高(P<0.01);治疗后,各组NT-proBNP含量均明显降低(P<0.01)。见表2。

表2 各组大鼠血清NT-proBNP含量的比较

3.3消饮化瘀方对大鼠心肌组织GPR35mRNA表达水平 与空白组相比,模型组GPR35mRNA表达水平明显升高(P<0.01);治疗后各组GPR35mRNA表达水平明显降低(P<0.01,P<0.05)。见表3。

表3 各组大鼠GPR35mRNA表达水平的比较

4 讨论

中医并无“心力衰竭”这一病名,近代医家认为《金匮要略》中记载的“心水”“支饮”与CHF的症状十分相近,认为水饮是导致心衰发生的关键。唐宗海的《血证论》中提出“血病不离乎水,水病不离乎血”的观点,认为水饮和瘀血之关系密切。治法上根据“病痰饮者,当以温药和之”的治疗原则及《经方例释》曰“葶苈本治心水,故《千金》十水丸,用以治赤水之从心肿者”。故选用的消饮化瘀方是以经方苓桂术甘汤合葶苈大枣泻肺汤为主方,加丹参、川芎、葛根组成,以化饮为主,兼以活血。2014年《慢性心力衰竭中医诊疗专家共识》中也同样指出活血化痰利水的治法[7]。史君等[10]将近20年CHF的临床用药规律进行分析,发现也是以益气、活血、利水的药物为主。说明消饮化瘀方与近代医家思路是一致的。

NT-proBNP主要由心室肌细胞释放,主要生理功能是舒张血管、利尿、抑制肾素-血管紧张素-醛固酮(RAA)和交感神经系统[11]。在CHF发生时,心脏内压力增高,NT-proBNP的分泌和合成增多,所以NT-proBNP的浓度反应了心衰的严重程度。在本研究中模型组的NT-proBNP含量明显高于空白组,提示CHF大鼠模型复制成功。治疗后各组NT-proBNP含量明显下降,提示消饮化瘀方能够有效改善CHF。这可能与消饮化瘀方利尿、扩张血管的功能密不可分。现代药理学表明葶苈子有强心、利尿、拮抗肾素-血管紧张素系统(RAS)等作用[12]。苓桂术甘汤合葶苈大枣泻肺汤具有调节水液代谢的作用[13-14]。葛根、丹参、桂枝等药具有扩张血管的作用[15-17]。

G蛋白偶联受体(GPCR)是最大和最多的基因家族之一,并构成最大的受体家族,很多临床药物都是通过此类受体来发挥作用[18]。GPR35是一种孤儿受体(尚未被内源性配体激活的受体),近年来被发现与心血管疾病关系密切,可作为治疗心血管疾病的新兴靶点[19]。相关研究发现GPR35的基因表达在人类衰竭的心肌中增加,认为可以将GPR35基因用于诊断心力衰竭,并作为治疗心力衰竭的可能药物靶点[20]。Ronkainen VP等[21]研究认为GPR35是一种新型的缺氧敏感基因,缺氧诱导因子 1 (HIF-1) 激活诱导GPR35过表达,导致肌动蛋白细胞骨架的排列,使心肌细胞发生形态学变化,从而介导心肌重塑。同时发现GPR35在缺氧导致压力负荷引起的心脏肥大、心肌梗死急性期及小鼠心衰模型中明显升高。贺磊[4]等研究发现使用GPR35活性抑制剂(CID2745678)能够抑制低氧环境导致的心肌细胞凋亡,改善心肌梗死后的心肌重构。这些研究提示心肌缺血缺氧是导致GPR35上调的一个主要因素,在CHF的发病中起着重要作用。

不同的心血管疾病都存在一定程度的缺血缺氧[22-24]。我们认为CHF的缺血缺氧与水饮、血瘀有密切关系。《素问·痿论》云:“心主身之血脉。”心脏健康,心气旺盛,血脉充盈,心主血脉功能正常,将血中的营养物质供给周身组织器官。反之,心脏受损,心主血脉功能失常,心阳不足,推动无力,则血行瘀阻;心阳不足,坐镇无权,不能镇摄寒水,则水饮邪气乘虚上逆凌心;心脏受损,水谷精微贯注心脉,不能顺利化赤为血,则致心血不足。血行瘀阻、水饮内停,阻滞了气血的运行,则心肌组织缺血缺氧,缺血缺氧又进一步加重了瘀血和水饮在体内的聚集,所以缺血缺氧与水饮瘀血形成一个恶性循环。在本研究中苓桂术甘汤合葶苈大枣泻肺汤消除了水饮,丹参、川芎、葛根祛除了瘀血,使气血运行通常,改善了心脏缺血缺氧的状态。现代药理研究证实丹参、葛根具有改善血液循环,抗心肌缺血缺氧的作用[25]。结合本研究结果,治疗后各组GPR35mRNA表达水平明显降低,提示消饮化瘀方可能是通过抑制GPR35表达,改善心肌缺血缺氧,从而防治CHF。