喉癌患者肿瘤组织中PINCH1表达水平与患者临床预后的关系

岳艳 刘勇 刘莉萍 金光裕

(1.陕西中医药大学附属第二医院耳鼻咽喉头颈外科 咸阳 712000；2.陕西省核工业二一五医院耳鼻喉头颈外科 咸阳 712000)

喉癌是上呼吸道最常见的恶性肿瘤之一，85%～95%为鳞状细胞癌[1]。喉癌患者的5年生存率约为60%，尽管在诊断和治疗方面取得了进展，但其生存率及死亡率并无显著改善[2]。癌细胞侵袭、复发及转移是导致患者手术失败及死亡的重要原因[3]。因此，识别及研究喉癌发生、进展过程中新的分子标志物对于提高喉癌患者的临床预后具有重要意义。PINCH1(particulary interesting new cysteine-histicline rich protein-1)是一种广泛表达于肺、心脏、子宫等组织的整合素链接激酶(intergrin-linked kinase， ILK)家族黏着斑蛋白，具有调节细胞存活与增殖、细胞迁移、ILK水平及功能的作用[4]。有研究[5-7]指出，PINCH1与肝癌、非小细胞肺癌、垂体腺瘤等肿瘤患者预后密切相关。然而，缺乏相关肿瘤组织中PINCH1表达水平对喉癌患者临床预后影响的研究报道。本研究收集86例喉癌患者的临床资料，探讨肿瘤组织中PINCH1表达水平与临床病理特征及5年总生存率的关系，为喉癌患者临床治疗提供循证医学证据。

1 资料与方法

1.1 资料 选择2009年1月～2013年12月在陕西中医药大学附属第二医院接受治疗的86例喉癌患者作为研究对象。根据喉癌组织中PINCH1表达水平将患者分为PINCH1阳性表达组(n=45)和PINCH1阴性表达组(n=41)。在不影响喉腔重建黏膜处，取同一患者癌旁正常组织(距离肿瘤边缘<10 mm)作为对照(n=86)。所有手术标本术后均经病理确诊。入组患者男性48例、女性38例；年龄45～83岁，平均(64.15±18.64)岁；有吸烟史33例、嗜酒史22例；行喉垂直部分切除术21例、喉水平部分切除术25例、喉全切除术40例。本研究获得本院医学伦理学委员会批准，且所有研究对象均知情同意。

纳入标准：根据国际抗癌联盟标准对喉癌标本进行TNM分期[8]；术前未接受放化疗，Ⅰ期患者若术后肿瘤复发，接受全身化疗，Ⅱ～Ⅳ期患者术后接受至少2个周期含铂方案两药联合放疗或化疗；术后病理证实为喉癌或癌旁正常组织；无其他脏器严重疾病；由患者或直系亲属知情同意并签署手术知情同意书，提供患者的详细资料。排除标准：伴有心、肝、脾、肺、肾等重要脏器损伤；合并其他恶性肿瘤；合并呼吸系统或血液系统疾病；精神疾病及言语功能障碍；随访资料不全；未签署手术治疗知情同意书。

1.2 方法 详细记录入组患者性别、年龄、吸烟史、嗜酒史、临床分期、分化程度、T分期、淋巴结转移、肿瘤部位等临床病理特征。吸烟史的定义是平均≥10支/d，持续10年以上；嗜酒史的定义是饮酒史5年以上，男性酒精摄入量>40 g/d，女性酒精摄入量>20 g/d。

采用免疫组织化学法检测PINCH1在喉癌组织和癌旁正常组织中的表达。标本经10%甲醛固定24 h，常规石蜡包埋并利用切片机(徕卡，RM2235，德国)切片。60 ℃烘片后，常规二甲苯脱蜡，梯度乙醇复水，柠檬酸缓冲液高压修复抗原，3%过氧化氢溶液封闭后滴加PINCH1一抗与二抗(Santa Cruz公司，sc-393133，美国)，二氨基联苯胺染色，苏木素复染，中性树脂封片。按照试剂说明书(BF06099-500，北京博奥龙免疫技术有限公司)进行操作。所有切片均采用双盲法由2位病理科医师独立阅片，在高倍镜视野下(×400)计数100个细胞。

免疫组化法结果判定：染色强度积分按不染色0分、浅黄色1分、黄色2分、棕黄色3分计算，记0～1分为PINCH1阴性表达，2～3分为PINCH1阳性表达；染色面积积分按染色细胞数占所有细胞数<5%记0分、5%～25%记1分、26%～50%记2分、51%～75%记3分、>75%记4分计算，记0分为PINCH1阴性表达，1～4分为PINCH1阳性表达[9]。

1.3 随访 患者术后每隔3～6个月复查1次CT、喉镜、B超或MRI，根据复查结果诊断是否复发，必要时行手术确诊。临床医师结合本院门诊复查病例资料及电话进行随访，随访时间61～81个月，平均(71.44±10.15)个月，随访至患者死亡或2018年4月1日。其中，总生存率为从入院时至因任何原因引起死亡的患者例数占全部人数的比例。

2 结果

2.1 PINCH1在喉癌组织及癌旁正常组织中的表达(图1) PINCH1在喉癌组织细胞质及细胞核中表达，染色呈浅黄色、黄色及棕黄色。PINCH1在喉癌组织中的阳性表达率为52.33%(45/86)，显著高于癌旁正常组织阳性表达率8.14%(7/86，P<0.05)。

图1. PINCH1在喉癌组织及癌旁正常组织中的表达(×400) A.PINCH1在癌旁正常组织中的表达；B.PINCH1在喉癌组织中低表达；C.PINCH1在喉癌组织中高表达

2.2 肿瘤组织中PINCH1表达水平与患者临床病理特征的关系 PINCH1在喉癌患者肿瘤组织中的表达水平与性别、吸烟史、嗜酒史、分化程度、肿瘤部位无关(P>0.05)，与年龄、临床分期、T分期、淋巴结转移显著相关(P<0.05，表1)。

表1 肿瘤组织中PINCH1表达水平与患者临床病理特征的关系

2.3 肿瘤组织中PINCH1表达水平与患者预后的关系 PINCH1阳性表达的喉癌患者5年中位生存时间为28个月，5年生存率为22.22%(10/45)；PINCH1阴性表达的喉癌患者5年中位生存时间为53个月，5年生存率为65.85%(27/41)。Log-rank法比较显示，PINCH1阳性表达的喉癌患者5年总生存率显著低于PINCH1阴性表达的喉癌患者(P<0.05，图2)。

2.4 影响喉癌患者预后的多因素Cox比例风险回归分析 将患者的年龄、临床分期、T分期、淋巴结转移以及PINCH1表达水平作为自变量，将患者5年随访时间作为因变量，建立Cox回归模型进行多因素分析。结果显示，临床分期(Ⅲ～Ⅳ期)、T分期(T3～T4期)、PINCH1表达水平(阳性)是影响喉癌患者预后的危险因素(P<0.05，表2)。

图2. 肿瘤组织中PINCH1表达水平与患者预后的关系

3 讨论

虽然喉癌发病率较低，但病情恶性程度高，患者预后差。本研究中喉癌患者的5年生存率为43.02%(37/86)，低于既往研究报道[2]，或许是由于本研究入组患者中Ⅲ～Ⅳ期、高分化、T3～T4期、淋巴结转移比例较大，患者机体条件偏差，临床病例资料差异导致。喉癌发病原因可能与吸烟、饮酒、空气污染、职业因素、病毒感染、性激素、微量元素缺乏、放射线等多种致癌因素有关[10-11]。然而，喉癌的确切发病机制目前仍不十分清楚。近几年，随着现代分子生物学的发展和临床诊断水平的提高，许多分子标志物的出现对于喉癌诊治及预后提供了新的参考。

表2 影响喉癌患者预后的多因素Cox比例风险回归分析

PINCH1属于ILK家族成员，最初作为衰老红细胞的重要标志物被大量研究[12]。PINCH1在胚胎发育整个过程及包括膀胱、肺、子宫、心脏等器官在内均有表达[13-14]。PINCH1可通过ILK结构域的双锌指结构与整合素连接酶N端的ANK重复序列结合，而整合素连接酶的C端则与整合素的胞质域结合，所构成的PINCH1-整合素连接酶N端/C端蛋白网络与肌动蛋白细胞骨架相连，介导细胞与细胞外基质的黏附及信号传导，并参与对细胞增殖、活动、分化及迁移等行为的调节。此外，PINCH1还可与受体酪氨酸激酶结合蛋白结合参与生长因子信号的传导途径。有研究[15-16]表明，PINCH1与一些人类肿瘤、糖尿病肾病等疾病的发生、发展密切相关。然而，PINCH1在喉癌中的作用机制仍然未知。本研究发现，PINCH1在喉癌组织中的阳性表达率显著高于癌旁正常组织的阳性表达率，且PINCH1表达水平与年龄、临床分期、T分期、淋巴结转移显著相关，提示PINCH1可能参与喉癌的发生、发展及转移等过程。此外，本研究发现PINCH1阳性表达的喉癌患者5年总生存率显著低于PINCH1阴性表达的喉癌患者，且PINCH1表达水平(阳性)是影响喉癌患者预后的危险因素。研究结果提示，PINCH1表达水平与喉癌患者临床预后密切相关。本研究或许提示PINCH1有望成为治疗喉癌的潜在靶点，且为以PINCH1为靶点研发治疗喉癌的分子靶向药物提供理论依据。本研究与Tsinias等[17]的研究结果一致，均指出肿瘤组织中PINCH1表达水平预测喉癌患者预后的重要价值，但机制还需进一步探讨。本研究还发现，临床分期、T分期与喉癌患者预后密切相关，与既往研究结果一致[18]。

本研究存在以下局限性：单中心研究，样本量较少，制约本研究结论的准确性；回顾性研究，容易造成选择偏倚；喉癌组织标本获取时间不一致造成组织中PINCH1检测时间不一致，或许对研究结果产生影响。总之，肿瘤组织中PINCH1表达水平可作为预测喉癌患者预后的指标。后期研究应根据PINCH1在肿瘤组织细胞质及细胞核表达差异，分类别对喉癌患者预后进行研究。