光感受器变性性疾病中视网膜二级神经元突触结构及功能的改变△

徐思思 倪颖勤

(复旦大学附属眼耳鼻喉科医院眼科 上海 200031)

光感受器变性性疾病是一组以感光细胞进行性凋亡，最终导致视觉功能异常甚至失明为特征的疾病，包括视网膜色素变性(retinitis pigmentosa，RP)、年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration，AMD)等，因发病机制不同而表现出不同的起病时间、光感受器凋亡程度、伴随的其他神经症状等。虽然近年基因治疗[1]、视网膜干细胞或祖细胞移植[2]、视觉假体[3]等治疗方式取得不断进展，但其临床应用仍受限。在患者与动物模型中，光感受器变性往往伴随着后续视网膜二级神经元显著的形态学改变，神经突触结构和功能变化可能是变性过程中二级神经元最早期的应激反应[4]。本文主要对RP和AMD中视网膜二级神经元突触结构与功能改变做一综述，以期为临床治疗提供新思路以及寻找更可靠的干预时间窗。

1 视网膜二级神经元的正常结构与功能

双极细胞和水平细胞是视网膜信号传递通路中的二级神经元，细胞核位于内核层(inner nuclear layer，INL)，树突和轴突位于外丛状层(outer plexiform layer，OPL)和内丛状层(inner plexiform layer，IPL)。该通路中主要的兴奋性氨基酸为谷氨酸，抑制性氨基酸为γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)和甘氨酸。根据上游的细胞不同，双极细胞可分为视杆双极细胞(rod bipolar cell，RBC)和视锥双极细胞(cone bipolar cell，CBC)。根据细胞上受体不同，CBC可进一步分为ON型和OFF型CBC。RBC和ON型CBC主要表达代谢型谷氨酸受体(metabotropic glutamate receptor，mGluR)，该受体位于树突末端[5]，被谷氨酸激活后会关闭一种非选择性阳离子通道TRPM1，使细胞超级化[6]。OFF型CBC主要表达离子型谷氨酸受体(ionic glutamate receptor，iGluR)，iGluR包含AMPA、kainate(KA)和NDMA3类，根据物种不同，大部分或全部OFF型CBC通过KA受体接收信号[7]，谷氨酸可激活KA/AMPA型离子通道使细胞去极化。IPL在解剖上可进一步分为5个亚层(S1～S5)，OFF型双极细胞轴突终止于靠外的2个亚层(S1～S2)，ON型双极细胞轴突终止于靠内的3个亚层(S3～S5)[8]。水平细胞的树突与轴突分别与视锥细胞、视杆细胞形成突触，负责横向调节视网膜信息传递。

2 光感受器变性过程中二级神经元突触结构的改变

研究中使用的RP动物模型超过20种，包括先天的(RCS大鼠[9-10]、rd1小鼠[11]、rd10小鼠[12-13])、转基因的(P23H-1大鼠[14]、TgP23H猪[15])和人工诱导的(光照、MNU[16])。由于啮齿类动物视网膜面积小，难以模拟黄斑区局部光感受器凋亡，以及遗传模型疾病进展缓慢限制了AMD动物模型的发展。近期有学者报道5XFAD小鼠模型[17]能够较好地模拟AMD。

2.1 突触前蛋白 众多学者对动物模型、RP患者、AMD患者二级神经元突触前膜蛋白质，如synaptophysin[10, 14, 18]、PSD-95[10, 14]、basson[14, 19]、SV2B[18, 20]的研究显示蛋白质表达减少与光感受器变性程度相一致。rd10小鼠视网膜中synaptophysin从P5开始发生改变，远早于P10视杆细胞外节形态改变，P18光感受器数量减少[21]。除了表达量下调以外蛋白质的位置也发生了改变，在AMD小鼠模型[22]和患者[23]中均发现原本位于OPL，偶尔出现于INL的突触前膜蛋白质VGLUT1、synaptophysin、CtBP2都在ONL被观察到。

2.2 RBC树突 RBC树突的分化依赖于正常的光感受器信号输入。在所有的光感受器变性模型中都观察到了RBC树突回缩现象。正常的RBC在OPL形成致密、竖直朝向ONL的树突丛。P18的rd10小鼠发育出正常形态的RBC，从P20开始，树突逐渐变得稀疏，开始回缩，P40时树突几乎完全消失[12]。相似的发现在MNU诱导变性模型[16, 24]、P23H-1转基因大鼠[14]、TgP23H猪[15]中也有报道。在rd1快变性模型中则从未观察到正常发育形态的树突[25]。在RCS大鼠、DKO小鼠等慢变性模型中还可观察到后期RBC异常出芽现象[19, 22]。有研究显示在AMD患者视网膜中可观察到RBC出芽，且周边视网膜比中央更显著[23]；然而也有学者报道在正常老年动物全视网膜中也可观察到RBC异常出芽现象[26]，具体机制未明。免疫荧光染色显示RBC异常突起上有mGluR6表达[22, 27]。Beier等[28]对光损伤模型视网膜中RBC树突方向进行矢量求和，发现树突具有指向损伤边缘的倾向性，说明RBC在失去原来的传入信号后主动寻找新的上游信号。在变性后期，RBC出芽有减少的趋势，推测当RBC与有功能的感光细胞形成新的突触连接以后会主动修剪多余的突起。

2.3 RBC轴突 正常的RBC轴突笔直穿过IPL，在IPL的S5亚层形成带有侧方曲张体的终泡结构。在rd1和rd10直至变性晚期，RBC在IPL的层次几乎没有受到影响[29-30]，然而RBC轴突的形态发生了改变。在rd10小鼠与P23H-1转基因大鼠模型中，均观察到RBC的终泡与曲张体逐渐缩小，在变性晚期阶段从外型上无法与CBC轴突末梢进行区分。但是直至变性晚期RBC轴突末梢仍存在低水平的VGluT1，提示它们可能仍有释放谷氨酸的能力[14, 30]。

对成年rd1小鼠IPL内与突触传递有关蛋白质进行定量分析发现，synaptophysin、SV2B表达上调，且该变化在OFF亚层更显著[20]。突触蛋白的上调提示双极细胞突触活动增强，可能解释了下游的三级神经元视网膜神经节细胞产生异常的自发性放电现象[31]。

2.4 CBC 由于缺乏特异、敏感的标记靶点，目前对CBC的研究非常有限。现有研究结果存在较大差异。Zhang等[22]在DKO小鼠模型上未观察到CBC树突在形态上与野生型存在任何不同。Berier等[28]也报道在光损伤模型视网膜上CBC树突数量与指向性未见明显异常，但是在rd1、Aipl1-/-和rd10小鼠中均观察到与RBC类似的树突回缩直至消失、胞体缩小、轴突缩短的变化，速度较RBC缓慢[11-12,32-33]。Chen等[34]通过回交GUS8.4-GFP与rd1小鼠，使7型CBC表达绿色荧光蛋白，从而对其进行观察。虽然也发现了树突回缩，但是与RBC从未发育出正常的形态不同，CBC在视锥细胞开始凋亡以后仍先发育成熟，且CBC凋亡速度和程度不呈现与感光细胞凋亡一致的中央-周边模式，与视网膜各离心度凋亡相似。研究[35]显示，RBC和CBC采用不同的分子机制与光感受器形成连接，综合考虑CBC与RBC在失去上游信号后不同的变化，推测视杆、视锥通路在失去传入后采用不同的修复方式。

2.5 水平细胞 在rd10小鼠视网膜中水平细胞突起从P20开始退缩，随着变性进展愈发显著，最终观察不到树突末梢[12, 30]。在RCS大鼠和P23H-1转基因大鼠模型中也观察到类似现象[14, 19]。除了树突退缩以外，在1月龄rd1和rd10小鼠视网膜中发现水平细胞轴突与胞体开始生出异常突起指向INL和ONL[30]，在Tg P347L兔模型和RP患者的视网膜上也存在这种出芽现象[18, 36]。有学者[22]报道这些异常突起上有mGluR6蛋白表达。当一些在光感受器释放递质过程中起重要作用蛋白的基因被敲除时(如钙结合蛋白4[37]、钙离子通道亚单位α1F[38])，模型上也可观察到水平细胞出芽现象。由此，推测正常的突触前膜释放功能对维持水平细胞突起正常的分层至关重要，而在光感受器变性模型中观察到的异常突起生成正是突触前膜功能异常的结果。在CNGA3/CNGB双敲除的A3B1小鼠上发现水平细胞早期出芽弥漫、无指向性，P28时出芽有所减少，残余的突起在ONL内与视杆细胞胞体形成了类似突触的接触，透射电镜下具有带状突触超微结构。此时进行微阵列分析发现在163个表达改变的基因中有64个与轴突导向信号通路有关，转录因子Tp53、Smad、Stat3信号通路被激活[27]，但是异常突起和突触形成的具体分子机制有待进一步阐明。

2.6 选择性 早期认为在成熟哺乳动物视网膜中，RBC与CBC的树突分别只与视杆、视锥细胞形成突触。后来在小鼠、猴、兔等动物中均发现存在某种OFF型CBC直接与视杆细胞形成连接[39-40]。在正常视网膜中，RBC与视锥细胞的连接也偶有报道[41]。然而，在变性模型中这种异常连接的发生率大大增加，说明视网膜丧失了这种选择性。早在2000年，Peng等[42]在P347L猪和rd小鼠中观察到RBC树突与视锥细胞之间形成了异常的突触。使用多焦ERG和药物分离出P347L猪外层视网膜与野生型不同的信号波形，可能主要来源于RBC和视锥细胞之间异常的连接[43]。这种异常的连接可能通过一种谷氨酸转运体EAAT5引发外层视网膜的自发电活动[44]。但是由于这2种模型均为快变性模型，有功能的突触要么生后很早便已丢失，要么在发育的过程中从未形成，无法推测异常突触的形成是光感受器变性后重塑的结果。后来又有学者在RCS大鼠[32]、Rho-/-模型[45]上观察到大量的RBC与视锥细胞形成连接现象，证实了错配是光感受器变性性疾病中普遍存在的现象，且在rd10小鼠上持续存在至变性晚期[30]。但是在Rho-/-、猪、猫模型上观察到的新突触为反折样结构[10, 46]，而在RCS大鼠[19]、rd10小鼠[13]上几乎所有的突触都为平突触。在视网膜中只有视锥细胞的模型中可同时观察到这两种异常的突触[47]。

在变性的光感受器主要是视锥细胞的CNGA3-/-模型上可观察到OFF型CBC与视杆细胞形成平突触，且突触末梢有Glu5受体表达[45]，从多电极记录到的数据强烈提示这种异常的突触有功能[48]。

在CNGA3-/-Rho-/-视杆、视锥都异常的模型上未观察到上述异常突触形成的现象[45]。Cao等[35]首次在分子水平上揭示了视杆细胞与RBC之间的选择性与视杆细胞轴突末端ELFN1蛋白有关，而ELFN1蛋白的正确定位要求感光细胞具有正常的神经递质释放功能。视锥细胞轴突末端可能也具有ELFN1类似蛋白起相似的作用，具体机制未明。

3 光感受器变性过程中二级神经元突触功能的改变

3.1 神经递质 大量研究报道了光感受器变性模型双极细胞中氨基酸水平的变化。Gibson等[49]发现rd1视网膜中谷氨酸、GABA、甘氨酸水平均有所下降。然而一项早期研究报道rd1视网膜中谷氨酸和谷氨酰胺水平较对照组升高[50]。除此以外，GABA和甘氨酸水平升高在RCS大鼠[9]中也有报道。研究结果有差异的原因，可能是使用的模型具体发病机制以及氨基酸定量方法不同。二级神经元中氨基酸水平变化早于形态学上的改变，说明二级神经元与光感受器间的突触功能在变性早期即受到影响。

3.2 受体 在许多变性模型中都观察到OPL mGluR6免疫荧光染色减低的现象。Borowska等[29]记录到rd1中ON型双极细胞静息电位比野生型更负提示mGluR6受体下调或减敏。Chua等使用一种能够通过开放的阳离子通道物质agmatine(AGB)显示在rd1中从P15开始，ON型双极细胞上mGluR6表达减少[51]。Dunn通过激光选择性消融视锥细胞，观察突触后ON型CBC受体表达情况，进一步证实光感受器变性对下游双极细胞受体的影响远早于其树突发生形态变化，大约在变性后2 h，突触后膜上的mGluR6丢失[52]。在rd10小鼠、RCS大鼠、Aipl1-/-小鼠视网膜变性的进展中，mGluR6在OPL的表达量逐渐下降，且出现在RBC的胞体与轴突[12, 19, 25, 53]。激活这些异位受体不能产生电流[13, 54]，有可能是因为受体密度太低，也可能是因为该受体与下游的TRPM1通道解偶联。

在变性的过程中，CBC上的离子型谷氨酸受体表达不变或下调。在rd10中发现直至变性晚期，AMPA受体(iGluR1、iGluR2、iGluR4)表达量仍然正常[13]；但是水平细胞上也有该受体表达，不能排除CBC上下调的可能性。KA受体的亚基GluK1荧光强度降至野生型的30%[55]。

在小鼠和兔视网膜中进一步研究发现，RBC丢失了mGluR6之后，改变了自身的谷氨酸受体，变成了OFF型双极细胞[56]；该现象同样见于RP患者[57]。正常灵长类动物视网膜中，ON型、OFF型CBC和RBC分别占30%、40%和30%，对RP患者视网膜双极细胞进行定量分析，发现ON型、OFF型CBC和RBC分别占27.5%、63.5%、8.95%[56]。Jones等[36]在Tg P347L兔模型中观察到OFF型细胞比例更高，可能是因为在该模型中视锥细胞大量凋亡，除了RBC以外部分ON型CBC也改变了受体。在rd1小鼠发现P15开始ON型CBC表达有功能的iGluR受体，但是P40后该受体消失[51]。

此外，Srivastava等[58]使用Western 印迹法对成年rd1小鼠视网膜各类受体进行分析，结果显示GluR1、甘氨酸受体、GABAA受体表达上调，仅有GABAC受体表达下调，GABAA受体上调与早期检测到rd1的RBC对GABA敏感性升高相一致[54]，也可以解释全细胞膜片钳上记录到的CBC产生自发电位的现象[29]。在光诱导变性的成年小鼠上也发现OPL内GluR2亚单位表达上调，但是30 d以后下降至正常水平[59]。

3.3 电生理 视网膜电图(electroretinogram，ERG)能记录光感受器变性视网膜早期电生理的变化，其中b波的峰值和到达峰值的时间反映ON型双极细胞突触的功能。在动物模型和RP患者中均记录到随着变性的发展b波振幅显著降低，诱导时间延长[60-61]。rd1小鼠在任何年龄都无法记录到视杆细胞介导的ERG，各种强度刺激下均显示b波潜伏期延长及振幅降低，且振幅下降程度较a波显著，提示CBC与视锥细胞之间突触传递障碍[11, 32]。也有学者认为虽然b波振幅显著降低，但a波、b波之间的回归系数与野生型无差异，b波的异常是光感受器传入信号减少所致，而不是二级神经元突触功能异常的结果[49]。Varela等[54]分离出4～8周rd1小鼠视网膜RBC，检测其对谷氨酸的反应，13个细胞中只有1个对谷氨酸产生反应。由于在rd1小鼠视网膜中视杆细胞与RBC的突触发育不正常，无法说明观察到的功能缺失是由发育异常引起还是由光感受器变性造成。

在rd10小鼠视网膜中，视杆细胞与RBC之间突触功能的改变，使得早在P18内层视网膜尚未出现明显形态改变时就可观察到ERG b波形态与振幅的变化[62]。Puthussery等[13]使用mGluR6的激动剂LAP-4记录到rd10小鼠视网膜RBC上由mGluR6诱发的电流呈进行性减少，P45时b波振幅较野生型下降了91%。而Barhoum等[12]观察了P60的rd10小鼠RBC对局部施加谷氨酸的反应，结果显示RBC膜电位的改变幅度与野生型无显著差别。实验结果之间相互矛盾可能是使用了不同的激动剂，从而导致激活的受体有差异。

使用全细胞膜片钳在P6M的rd10上记录到OFF型CBC的电流与野生型无显著差别[13]，提示变性晚期iGluR仍具有正常的功能。但是Marc等[57]联合使用KA激动剂和AGB，发现hrhoG小鼠视网膜内OFF型CBC内无信号，说明iGluR反应消失。虽然在一RP患者视网膜组织中检测到正常的iGluR信号，但是不能排除该信号来源于异常表达iGluR的ON型细胞[57]。

4 展望

虽然目前对光感受器变性性疾病的认知大部分来源于各类动物模型，但来源于患者的有限研究结果表明啮齿类动物、兔模型确实能准确地复制出患者身上从早期到晚期各阶段的变性与改变。视觉信息的传递始于双极细胞的树突末梢，大量研究已证实变性性疾病早期便累及光感受器与二级神经元之间的突触传递。异常的突触不仅影响双极细胞和水平细胞的形态与功能，还会引起内层视网膜环路的改变，对视力产生快速、显著的影响。任何视网膜神经保护策略都不应仅关注如何挽救视网膜神经元免于死亡，确保正常的突触结构和功能是视觉功能恢复的关键。因此研究变性过程中二级神经元突触结构与功能的改变，对于后续进行靶向干预，从而挽救视力有着积极的意义。