自体脂肪移植治疗增生性瘢痕的研究进展△

于金超 张天宇

(复旦大学附属眼耳鼻喉科医院眼耳鼻整形外科 上海 200031)

瘢痕组织是皮肤创伤愈合过程中自然形成的产物，理想的愈合应产生不太明显的瘢痕。增生性瘢痕(hypertrophic scars，HTSs)是皮肤愈合过程中产生的病理状态，其机制不甚明确，但在创伤愈合过程中炎症期、增殖期和重塑期的任何一个阶段产生调节异常，均可导致HTSs的发生。HTSs的病理特征表现为表皮层和真皮层增厚、角质细胞增生、大量成纤维细胞和肌成纤维细胞、血管增生、胶原组织含量和排列异常等[1]。全球每年有数百万以上的人因各种原因而形成瘢痕[2]，严重烧伤后30%~90%患者会发展为HTSs[3]。大约70%的患者HTSs发生在关节附近或身体其他皮肤紧致部位，在受伤后6~12个月真皮发生纤维化，形成隆起、僵硬、发痒的瘢痕，产生瘢痕挛缩，严重影响美观，并导致生活质量下降。HTSs形成过程中主要表现为皮肤过度纤维化增生，伴有过度的成纤维细胞增殖和异常胶原蛋白沉积。多种方法应用于HTSs的治疗，包括传统的压迫治疗、局部或全身应用糖皮质激素、抗肿瘤药物局部注射、激光治疗、手术切除、自体脂肪移植和放射治疗等[2]。但迄今为止，尚未形成一个HTSs治疗的金标准。自体脂肪移植由于移植物获取简易，且可进行注射移植，在组织修复和再生领域中引起了学者的关注和重视。自体脂肪移植和脂肪来源间充质干细胞(adipose-derived stem cell，ADSC)逐步应用于病理性瘢痕的治疗。临床研究和基础性实验证实ADSC可在HTSs的治疗中发挥作用[4-5]，可以有效修复面部及身体的功能和美观。但自体脂肪移植后改善瘢痕的基本机制尚未明确，由于脂肪注射量与瘢痕相比较小，注射后局部容积的变化并不能很好地解释自体脂肪移植的抗瘢痕作用。因此，目前推测ADSC多向分化能力、自身分泌的可溶性因子、与瘢痕组织细胞之间的相互作用等，可能与其抗瘢痕作用有关。本文就自体脂肪移植治疗HTSs的作用机制研究进展进行系统综述。

1 ADSC的生物学特性

皮下脂肪组织主要由成熟的脂肪细胞和血管基质组分(stromal vascular fraction，SVF)组成，后者包括成纤维细胞、内皮细胞、前脂肪细胞、血管平滑肌细胞、淋巴细胞、单核细胞和ADSC等，SVF中64% 为ADSC[6]。自Zuk等[7]于2001年首次在抽脂手术后的脂肪组织中分离出ADSC后，ADSC在多个不同领域展现了其临床应用潜力。ADSC来源广泛，取材较易，具有自我更新、稳定生长、组织修复和多向分化潜能等。成体干细胞缺乏特异性和通用的分子标记，必须使用多种分化的功能测定法来鉴定干细胞。用于标记ADSC的蛋白包括黏附分子、受体分子、表面酶、细胞外基质蛋白、糖蛋白和组织相容性抗原等[8-9]，但不表达造血细胞标记物，例如CD14、CD31、CD34和CD45[9]。ADSC具有可分化成中胚层、内胚层和外胚层3个胚层的能力，包括脂肪细胞、软骨细胞、成骨细胞、神经元细胞、心肌细胞、肝细胞、胰腺细胞和内皮细胞等[8]，与骨髓干细胞相比，其软骨分化能力弱。ADSC的克隆率高于骨髓干细胞，两者之间具有相似的抑制T细胞增殖的能力。

2 ADSC的旁分泌作用

在特定的微环境中，ADSC可分泌大量特定生长因子、细胞因子或其他旁分泌因子等，促进伤口愈合。有研究[10]表明机械损伤可促进脂肪组织分泌成纤维细胞生长因子-2 (f ibroblast growth factor-2， FGF-2)、转 化 生 长 因 子-β (transforming growth factor-β，TGF-β)、表 皮 细 胞 生 长 因 子(epidemal growth factor，EGF)、血小板衍生生长因子(platelet derived growth factor，PDGF)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor，HGF)等，而通过脂肪抽吸术获取的脂肪移植物本身就是一种严重的损伤过程，其移植至修复部位后将启动伤口愈合的级联过程，ADSC及其分泌物在这一过程中起到了重要作用。FGF-2可上调HTSs成纤维细胞基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases-1，MMP-1)和HGF的表达[11]，而阻断FGF-2后可增加纤维化程度[12]。动物实验也证实FGF-2可减轻瘢痕的形成[11]。PDGF与HTSs中成纤维细胞向肌成纤维细胞的转化高度相关[13]。HGF可通过依赖JNK途径在抑制纤维化过程中发挥重要作用，阻断HGF后可增加纤维化程度[12]。HGF也可有效抑制纤维化相关因子，调节HTSs中 ECM重塑[14]。

白细胞介素-10(interleukin-10，IL-10)是ADSC旁分泌的主要抗炎因子之一，与TGF-β和其他炎症因子相比，IL-10可抑制纤维化[15]，发挥其抗瘢痕作用[16]，但其抗瘢痕的机制不甚明确，可能与降低炎症反应、减少ECM形成和调节成纤维细胞的迁移、侵袭、转化和凋亡等有关。IL-10也可能会下调IL-6和IL-8的表达，发挥其抗瘢痕形成作用[5]。也有研究[1,17]指出，IL-10的抗瘢痕作用可能与PI3K/AKT和STAT3信号通路或STAT3和AKT-mTOR信号通路之间相互影响有关。此外，IL-10可显著下调Ⅰ型、Ⅲ型胶原和α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)的表达，并上调MMP-1和MMP-8的表达[15]。

3 ADSC和TGF-β/ Smad信号通路的调节

TGF-β是一种多功能生长因子，包括TGF-β1，TGF-β2和TGF-β3 3种亚型，与TGF-β Ⅰ型和Ⅱ型受体结合后[18]，诱导下游靶点Smad的激活，发挥生物学效应，在结缔组织重塑和ECM基因表达调节中发挥重要作用。体外实验发现，在机械应力的作用下，瘢痕疙瘩成纤维细胞与正常皮肤成纤维细胞相比，mRNA和蛋白质水平均高表达TGF-β1、TGF-β2和胶原[19]。HTSs中的成纤维细胞高表达α-SMA，并可持续自分泌TGF-β1。TGF-β1也可促进α-SMA的表达[20]，α-SMA蛋白的表达与肌成纤维细胞的收缩密切相关。TGF-β1可刺激组织金属蛋白酶抑制剂(tissue inhibitor of metalloproteinases，TIMP)的合成，进而抑制MMP介导的细胞外基质(extracellular matrices，ECM)的降解[18]。与TGF-β1在损伤后数分钟即可由血小板释放相比，TGF-β2和TGF-β3在损伤发生后24 h内缓慢升高[18]。另外，TGF-β1主要在成人组织中表达，而胎儿组织中主要表达TGF-β3，TGF-β3可能与胎儿无瘢痕愈合相关。ADSC可显著抑制TGF-β1和α-SMA的表达[5]，导致TGF-β/Smad信号通路中下游Smad2和Smad3磷酸化减少[5]，其磷酸化的减少在一定程度上阻断了TGF-β1刺激成纤维细胞转换为肌成纤维细胞的生物学效应，改善了瘢痕的形成。Zhang等[16]在动物实验证实，在瘢痕模型病灶内注射ADSC后，可降低α-SMA和Ⅰ型胶原的表达，并可以改善胶原蛋白沉积和排列，减少HTSs的形成。另有动物研究[21]发现，在ADSC注射到瘢痕组织后的早期会出现TGF-β3和MMP1的上调，晚期出现α-SMA和TIMP的减少。ADSC调节TGF-β1、TGF-β3以及相关信号通路中细胞因子的变化提示ADSC可能通过TGF-β/ Smad信号通路发挥其抗瘢痕作用。

4 ADSC和p38/MAPK信号通路的调节

p38/MAPK是一个经典的丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路，是细胞外信号传送到细胞内的一类重要信号通路，通过线粒体死亡途径、细胞分化或血管紧张素Ⅱ的激活等影响HTSs的形成[22]。有研究表明ADSC-CM降低了Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原和α-SMA的表达以及影响胶原蛋白的排列。ADSCCM处理的HTSs成纤维细胞中p-p38蛋白水平呈现浓度依赖性下调。加入p-p38抑制剂后可出现Ⅰ型胶原、Ⅳ型胶原和α-SMA表达的下降，p38的加入则出现相反的结果[22]。p38/MAPK信号通路可能是ADSC抗瘢痕的潜在机制之一。

5 ADSC的免疫调节作用

过度的炎症反应是HTSs形成的一个重要因素。受伤即时血小板、激活的补体和凝血因子等形成纤维蛋白凝集块，刺激炎症细胞(中性粒细胞、巨噬细胞和肥大细胞等)募集，后者进一步产生促炎介质，包括巨噬细胞炎性蛋白-1α、MCP-1、调节正常T细胞表达和分泌的活化因子、IL-1β和IL-6等。之后ECM的形成和重塑同样有多种炎症细胞和细胞因子参与其中，如前所述，TIMP和MMPs在ECM的降解中发挥重要作用。有文献[21,23]报道ADSC在伤口愈合过程中具有减轻炎症反应的作用。除了前面所提到的一些生长因子和抗炎因子外，ADSC也可自分泌前列腺素E2 (prostaglandin E2，PGE2)，PGE2可调控T细胞的增殖和分化[23]，抑制其免疫反应。与T细胞同时大量存在于活跃期瘢痕组织的肥大细胞和朗格汉斯细胞在脂肪注射后其数量明显减少[21]。巨噬细胞在受伤早期即募集到伤口周围，清理损伤细胞和异物等。在炎症反应过程中巨噬细胞可进行M1型和M2型的转换，ADSC可促进巨噬细胞由M1型转换为M2型[24]。M1型高表达促炎性细胞因子，并可促进Th1细胞发挥功能；而M2型低表达促炎细胞因子和高表达抗炎细胞因子，可促进Th2细胞发挥功能。如M1型巨噬细胞存在时间较长则将不利于伤口的愈合，M1型转换为M2型后有利于伤口愈合[23]。PGE2作用于T细胞后可促进Th1细胞向Th2细胞的转换[25]，与巨噬细胞的转型相互发挥协同作用，免疫细胞在炎症后期的转型对瘢痕增生和重塑起到了至关重要的作用。因此ADSC通过分泌抗炎因子、抑制炎症介质分泌、促进免疫细胞转型和减少免疫细胞的数量等联合发挥免疫调节作用。

6 ADSC的抗氧化作用

组织受到损伤后，局部的低氧环境会导致氧自由基(reactive oxygen species，ROS)的产生，ROS对TGF-β1/Smad通路的激活和下游因子的调控有着积极的促进作用。Kim等[26]通过体外培养实验发现了ADSC对皮肤纤维化的抗氧化作用，通过减少细胞凋亡来保护其免受氧化损伤。ADSC条件培养基中含有许多已知的抗氧化因子，包括胰岛素样生长因子、胎盘生长因子、PDGF，VEGF、FGF、HGF、IL-6、IL-8和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)等。同时ADSC条件培养基可增强成纤维细胞中SOD和谷胱甘肽过氧化物酶(glutathioneperoxidase，GPx)的 活 性。SOD和GPx是细胞内抗氧化的重要分子。ADSC-CM也可有效清除过氧化氢并抑制脂质过氧化，并可影响成纤维细胞中MMPs和TIMP的表达[27]。ADSC在局部微环境的影响下可通过其抗氧化作用影响瘢痕的纤维化和重塑过程。

7 自体脂肪移植在瘢痕中的应用

1893年Gustav Neuber首次将手臂脂肪组织移植到眼眶以纠正骨髓炎后的瘢痕后遗症。1974年Fisher提出了脂肪抽吸技术，随后1985年Klein提出了肿胀液的应用更加促进了脂肪抽吸技术的发展。黄振等[28]前瞻性研究报道二氧化碳点阵激光联合自体脂肪注射治疗HTSs的有效率明显高于单纯激光治疗，可明显减轻疼痛、瘙痒症状，改善瘢痕外形美观情况。王斐等[29]报道的80例瘢痕患者中乳糜脂肪移植组的术后温哥华瘢痕量表(Vancouver scar scale，VSS)评分与术前相比，差异有统计学意义，而生理盐水注射组的术后VSS评分与术前相比，差异无统计学意义。由此指出乳糜脂肪移植对HTSs有良好的治疗效果，其作用可能与ADSC、ECM、脂肪前体细胞及其分泌的细胞因子等有关[29]。另一篇随机对照试验(randomized controlled trial，RCT)研究发现，自体脂肪移植术后，医师客观评估和患者自我评估均显示出瘢痕状况得到改善，但与生理盐水对照组相比，瘢痕的硬度、弹性、颜色评分和血管走形，胶原的重塑，慢性炎症等组织学指标均无明显差异[30]。但同时这篇文献也指出了自身存在的可能缺陷，包括入组数量较少(仅有17例)、单次自体脂肪移植、无其他治疗，以及年龄、病因和部位等因素的不确定性等。多数文献[4,28-29]报道自体脂肪移植治疗为3次，但对治疗次数和治疗间隔时间目前并没有统一的标准。亟须多中心、大样本的RCT研究对自体脂肪移植治疗HTSs进行分析对比。 Sataloff 等[31]首次报道了4例自体脂肪移植治疗因声带瘢痕而引起言语障碍的患者，术后随访10个月~3年，嗓音质量得到改善。Neuenschwander 等[32]报道了8例因严重瘢痕和发音困难而进行脂肪移植的患者，平均随访时间为23个月，声门关闭、黏膜波、僵硬程度和嗓音嘶哑评估(GRBAS)评分均有显著改善。Cantarella等[33]报道了7例Nano 脂肪注射治疗广泛声带瘢痕引起的严重发音障碍患者，术后所有患者的嗓音质量和吞咽功能均得到改善。Kim等[34]将人ADSC注射到兔声带损伤瘢痕动物模型，评估其高速摄影、声学功能性指标、苏木精-伊红染色和免疫组织化学指标，与未进行ADSC注射组相比，ADSC改善了声带ECM和过度沉积的I型胶原。胡蓉等[35]研究ADSC移植到损伤声带后的分布及对声带固有层及ECM变化的影响，发现单纯声带损伤3个月后局部出现瘢痕挛缩，大量纤维组织增生，持续至12个月；ADSC植入损伤声带后，形态6个月时接近正常，部分组织学结构在12个月时类似声带。ADSC可以促进ECM分泌并合理有序地分布和排列在声带固有层内。声带脂肪注射是治疗严重和(或)广泛的声带瘢痕一种有效和实用的方法。

综上所述，自体脂肪移植后改善瘢痕的作用机制可能是多种分子机制共同介导的。目前的研究多集中于ADSC通过旁分泌因子、多种不同信号通路相互影响作用于瘢痕组织成纤维细胞和ECM，对ADSC的多向分化潜能研究较少，间充质干细胞在创伤愈合的局部会分化成真皮细胞，但其在瘢痕组织微环境中是否会发生相似的变化目前不甚明了。ADSC对早期和晚期HTSs的抗纤维化作用机制是否不同，需要进一步深入的研究，在可靠的动物模型基础上进行实验验证。在HTSs发生时进行干预阻断其发生、发展过程，可较高水平提高患者的生活质量。自体脂肪移植物中抗纤维化的旁分泌因子(如TGF-β3、骨形态发生蛋白、HGF、bFGF等)可能是药物治疗HTSs的潜在靶点。