青光眼神经保护基因治疗的研究进展

麦尔哈巴·肖开提 莫晓芬

·综 述·

青光眼神经保护基因治疗的研究进展

麦尔哈巴·肖开提 莫晓芬

青光眼以进行性视网膜神经节细胞(RGCs)的丢失及其轴突变性为特征，其临床表现为典型的视神经萎缩和视野缺损。因此，延缓或阻止RGCs凋亡的神经保护性措施应作为主要治疗手段。本文通过补充神经营养因子，调控线粒体功能，抑制细胞凋亡通路和毒性作用等几个层面，对基因治疗在RGCs抗凋亡和促进存活作用的最新研究进展进行综述。(中国眼耳鼻喉科杂志，2015，15：437-440)

青光眼是一类以特异性的视神经损害和视野缺损为特征的眼病，已成为白内障后第2位致盲性眼病。最新研究[1]结果显示，至2020年，全世界青光眼患者的数量将达到7 000万。青光眼主要的病理变化是视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells，RGCs)的不可逆丧失。目前对青光眼的治疗，主要以药物或手术的方法降低眼压，可是相当一部分患者尽管眼压控制满意，但视功能还继续恶化；究其根源，是由于发生细胞凋亡的病理微环境持续存在，使得神经元数量不断减少，造成视功能进行性下降。因此寻找更为有效的治疗方法保护神经元或延缓其凋亡迫在眉睫。基因治疗因具有组织特异性高、可长时间持续等特点，对此类慢性终身性疾病的治疗具有无可比拟的优势，因而受到业界的关注，成为研究热点[2]。

至今为止，有研究[3]报道了在各类青光眼患者中至少存在29个异常基因位点，其中已明确12个为致病性基因。但是在实行基因治疗前，需要进一步明确青光眼基因缺陷和RGCs凋亡病理生理间的关系。此外，除了基因缺陷因素，还有个体风险因素、环境因素均可以影响青光眼的发生和发展。由于上述原因，目前对青光眼基因治疗策略，主要考虑如何增强RGCs的存活和再生，而非单纯修正遗传缺陷。

随着病毒和非病毒基因载体的出现，更多的研究证实了基因治疗在保护视网膜神经元、延缓RGCs凋亡方面的功效。因此，本文对基因治疗在RGCs抗凋亡和促进存活方面的研究进展进行综述。

1 基因治疗载体

1.1 腺相关病毒载体 腺相关病毒(adeno- associated virus，AAV)是一种小的单链DNA病毒，具有非免疫原性、基因表达持续时间长等优点[4-5]。在成年大鼠玻璃体腔注射AAV载体，能有效地转染RGCs，转染率达到68%[6]；而在视网膜下腔注射AAV载体，主要转染感光细胞和视网膜色素上皮层[7-8]。目前应用于基因转染的AAV载体具有9种血清型，其中AAV-6载体对RGCs的转染率较低，只有24%，其他血清型对RGCs的转染率为57%～71%，其中AAV-2最高[9]。

1.2 腺病毒载体 最初的腺病毒(adenovirus，Ad)又叫复制缺陷病毒，具有稳定、转染率高等优点，但由于强免疫原性及毒性反应，研究者对Ad载体进行了改进。第3代Ad载体又叫辅助病毒依赖性Ad载体(helper-dependent adenovirus，Hd-Ad )，此类病毒基因只保留了两段复制区域，其他结构被外源基因序列所替代。这种新病毒载体由于缺失大部分病毒编码序列，因而有效地减少了机体的免疫反应，使基因表达持续时间明显延长[10]。Ad载体能够有效地转染上皮细胞和神经胶质细胞。研究[11]发现，在小鼠玻璃体腔注射Hd-Ad-GFP载体，基因产物在Müller细胞中能够持续稳定表达可长达1年。在视网膜下腔注射Hd-Ad载体，能有效地转染视网膜色素上皮层[12]。

1.3 非病毒载体方法 与病毒载体相比，非病毒载体基因转染方法相对安全，不会引起免疫反应；但转染率低、持续时间较短。电穿孔方法是物理导入方法之一, 具有操作简单、安全、转染率不受细胞增殖性影响等优点, 是一种良好的外源基因导入系统。研究显示，在SD大鼠视神经横断伤模型及视网膜色素变性大鼠模型上，利用此方法成功地将脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor ，BDNF)转染到RGCs层或视网膜色素上皮层，观察到基因治疗后能产生持久显著的神经元保护效果[13-14]。

2 基因治疗策略

2.1 补充神经营养因子 神经营养因子对视网膜神经元的存活、分化及建立突触联系至关重要，营养因子的剥夺是诱发青光眼RGCs凋亡的重要因素之一。已有研究表明，眼内注射神经营养因子能暂时性拯救损伤视网膜神经元，采用基因治疗的方法转染这些神经营养因子，起到更好地持久保护效果并能克服眼内多次注射带来的各种并发症。

2.1.1 BDNF 在神经营养因子家族中，BDNF对受损RGCs的保护作用尤为突出。玻璃体腔局部注射外源性BDNF蛋白可以促进视神经损伤后RGCs的存活，通过病毒载体或活体电穿孔辅助技术，将外源性BDNF基因转染到RGCs层，其保护效应更持久。Martin等[15]研究发现，在大鼠慢性高眼压模型上，玻璃体腔单次注射AAV-BDNF治疗，治疗组比对照组能显著增加RGCs的存活率。尽管BDNF具有显著的神经保护效果，但这种作用是暂时性的。BDNF能延缓RGCs的凋亡，却不能阻止凋亡进展，这跟RGCs表面TrkB受体的表达下调相关[16]。研究[6]表明，在视神经横断伤大鼠模型上，利用AAV载体将TrkB基因转染到RGCs层，玻璃体腔注射BDNF蛋白，能显著提高对RGCs保护效果及延长作用时间。

2.1.2 睫状神经营养因子 睫状神经营养因子(ciliary neurotrophic factor，CNTF)是具有保护RGCs和促进轴突再生作用的神经营养因子，在多种视神经损伤动物模型中，外源性补充CNTF起到显著的神经保护和再生效果。在大鼠慢性高眼压模型中，玻璃体腔注射AAV-CNTF治疗，与对照组相比存活的RGCs轴突数量超过15%[17]。NT-501是Neurotech公司研发的一种分泌CNTF的植入装置，通过细胞封装技术将分泌CNTF的细胞系装入一种生物半透膜而制成，NT-501通过手术植入到睫状体平坦部后，能稳定地分泌CNTF。这种装置已经通过了视网膜色素变性和老年黄斑变性的第2期临床试验[18]，并于2011年开始进入了原发性开角型青光眼第1期临床试验(clinical trials.gov NCT01408472)，其疗效值得期待。

2.1.3 色素上皮源性因子 色素上皮源性因子(pigment epithelium-derived factor，PEDF)是一种具有抑制内源性新生血管形成和神经保护作用的蛋白质，相对分子质量为50×103。Miyazaki等[19]研究发现，在Wistar大鼠急性缺血再灌注模型中，视网膜下腔注射猿猴免疫缺陷病毒(SIV)载体表达的人类PEDF基因(SIV-hPEDF)，结果表明，PEDF过表达能明显提高受损视网膜神经元的存活率。又有学者[20]发现，在成年大鼠视神经挫伤模型中，玻璃体腔注射PEDF还具有促进RGCs轴突生长的效果，联合环磷酸腺苷(cyclicAMP，cAMP)治疗，轴突延长作用更加显著。

2.1.4 其他 除了上述神经营养因子之外，成纤维细胞生长因子-2(fibroblast growth factor-2，FGF-2)和胶质细胞源性神经营养因子(glial cellline-derived neurotrophic factor，GDNF)也同样具有神经保护效果[21]。研究[22]表明，视神经损伤后，FGF-2在视网膜内核层及RGCs层的表达上调；在大鼠神神经损伤模型上，经玻璃体腔注射AAV-FGF-2载体，能诱导损伤后RGCs轴突的延长。在大鼠视神经横断伤模型中，利用电穿孔法将GDNF基因转染到RGCs层，视神经损伤后2周及4周，能观察到显著RGCs保护效果，与BDNF联合治疗，效果更显著[23]。

2.2 阻断细胞凋亡通路 视网膜神经元凋亡是视神经变性性疾病的共同病理基础。包括内在和外在的凋亡通路共同调控着RGCs的凋亡[24]。外在凋亡信号通路包括一系列的死亡受体家族：Fas-L、TNF-α、TNF-相关凋亡诱导配体等。外在信号通路的激活能诱导RGCs凋亡。在青光眼病理模型中，能观察到Fas-L、TNF-α的表达上调[25]。虽然外在信号通路在RGCs的凋亡中起到关键作用，但目前基因治疗在这方面应用较少。

内在信号通路主要包括Bcl-2家族成员：促凋亡(Bax、Bad、Bid)和抗凋亡(Bcl-2、Bcl-XL)因子，共同调控着线粒体外膜的通透性，控制细胞色素C释放到细胞质中，而细胞色素C的释放可以激活促进细胞凋亡的半胱氨酸蛋白激酶(caspase)家族。因此内在凋亡信号通路的各种因子已经作为基因治疗的靶向目标，用来研究对RGCs保护作用。研究[26-27]发现，在视神经横断伤动物模型中，通过基因转染使抗凋亡基因Bcl-2或Bcl-XL过表达，能显著提高RGCs的存活率。

最近研究证实，在成年大鼠视神经横断伤模型中检测到caspase-2在RGCs中有表达和激活，利用siRNA技术阻断caspase-2的表达，起到显著的神经保护效果。有关caspase-2的研究目前正处于非动脉炎性前部缺血性视神经病变的第1期临床试验阶段[28]。

2.3 调控线粒体功能 长期以来，线粒体一直被公认为是细胞内的能量加工厂，然而越来越多的研究发现，线粒体具有调控细胞凋亡的作用。细胞凋亡过程中许多重要环节与线粒体的功能密切相关，包括caspase激活因子的释放、线粒体膜电位的丧失、细胞内氧化还原状态的改变、Bcl-2家族促进和抑制凋亡蛋白的参与等。

OPA-1是GTP酶类动力蛋白，能稳定线粒体的嵴结构，减轻线粒体结构的破坏，从而减少细胞凋亡。在多数常染色体显性遗传的视神经萎缩患者中，发现编码OPA-1的基因出现突变，而OPA-1蛋白功能的丧失导致线粒体分裂、细胞色素C释放、线粒体DNA损伤和增加活性氧产物，最终引起细胞凋亡。在DBA/2J小鼠(一种先天性基因缺陷小鼠)，通过AAV载体使OPA-1基因过表达，可以增加存活的RGCs数量，并能显著降低活化的星形胶质细胞和小胶质细胞的数量[29]。

脑红蛋白是神经系统特异的携氧球蛋白，与脑内供氧密切相关，推测与线粒体之间存在着功能链接。Hq小鼠由于呼吸链复合体1的缺陷，引起RGCs的变性和视神经萎缩。研究者通过AAV载体介导的基因转染方法使Hq小鼠脑红蛋白过表达，脑红蛋白能稳定表达7个月，并无引起视网膜结构和功能变化，相反起到了保护RGCs和轴突的作用。提示脑红蛋白通过修复呼吸链功能的缺陷，而发挥保护视觉功能的作用[30]。

Leber遗传性视神经病变是线粒体DNA突变引起的特征性RGCs凋亡的一种罕见疾病。ND4是线粒体DNA呼吸链复合物NADH脱氢酶第4亚单位区域基因。利用电穿孔基因转染方法将野生型人类ND4亚基因转染到Leber视神经病变大鼠模型中，能够起到保护RGCs的作用。在电穿孔转染后第48天，与野生型ND4基因组相比，突变ND4基因组存活的RGCs数量下降了38%[31]。最近AAV载体介导的ND4(AAV-ND4)基因治疗在Leber遗传性视神经病变第1期临床试验中显示了安全性[32]。

2.4 抑制细胞毒性作用 在青光眼的发病机制中，兴奋性毒性、离子失衡、氧化应激通过激活多种受体和通路引起RGCs的凋亡。高水平的谷氨酸过度刺激NMDA受体，导致细胞内Ca2+超载,产生过多的一氧化氮和活性氧类，导致细胞毒性[33]。利用NMDA受体拮抗剂,阻断RGCs表面NMDA受体和兴奋性氨基酸的结合,可以减轻低氧、兴奋性毒性等对RGCs的损伤,从而达到保护效果；但NMDA受体拮抗剂美金刚在第3期临床试验中失败[34]，提示谷氨酸兴奋性毒性可能存在其他途径，包括临近的细胞，尤其是胶质细胞。研究[35]证明Müller细胞对谷氨酸兴奋性毒性作用极其敏感，并能上调TNF-α引起RGCs凋亡。兴奋性毒性的作用分子通路已被多种药物、拮抗剂来抑制，但是基因治疗在这方面还没有被应用。

影响细胞凋亡的其他因素是通过引起细胞离子失衡，而导致细胞皱缩和凋亡。研究证实，细胞皱缩发生在线粒体功能出现异常之前，更重要的是，细胞皱缩和凋亡伴随着K+电流的增加以及胞内的K+离子水平的降低。因此K+通道在RGCs凋亡过程中也起到关键作用。研究[36]指出，用siRNA介导方法去除K+通道中的kv1家族，能有效地保护RGCs。

氧化应激由活性氧产物和抗氧化剂间的失衡引起，是RGCs受损和凋亡的另一重要原因。SOD2是一种抗抗氧化物歧化酶。研究[37]证明，Wistar大鼠玻璃体腔注射AAV载体表达的SOD2(AAV-SOD2)，注射后21 d进行缺血再灌注损伤显示，实验组能明显降低超氧离子、丙二醛(MDA)、8-羟脱氧鸟苷(8-OHDG)、硝基酪氨酸水平，并能挽救RGCs和内丛状层受损。

3 结语

视网膜保护性治疗对于青光眼等视神经变性性疾病来说，显得非常重要。在过去的十几年中，基因治疗在了解RGCs凋亡的分子机制、促进RGCs存活和再生方面取得了巨大进展。相关研究也从动物实验进展到个别致盲性眼病的临床试验当中。尽管仍存在不少问题, 但它具有普通治疗措施所难以达到的优越性。基因治疗是否能够成功地应用于青光眼或其他视神经变性疾病的治疗，除了对疾病的发生、发展有进一步的认识外，还有待于转基因载体或基因转染方法的进一步改进, 使其降低毒副作用的同时提高转染效率，同时提高组织特异性。随着对青光眼发病机制和遗传基础的理解加深，相信基因治疗在不久的未来会逐步应用到这类疾病的治疗。

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(本文编辑 诸静英)

复旦大学附属眼耳鼻喉科医院眼科 上海 200031

莫晓芬(Email: xfmo@fudan.edu.cn)

10.14166/j.issn.1671-2420.2015.06.020

2015-04-27)