3型Stargardt病及其致病基因ELOVL4的研究进展△

陆勤康 吴佩蓓 赵娜 刘昊

·综 述·

3型Stargardt病及其致病基因ELOVL4的研究进展△

陆勤康 吴佩蓓 赵娜 刘昊＊

3型Stargardt病(STGD3，MIM600110)是一种常染色体显性遗传的早发性黄斑营养不良性疾病，是一种单基因遗传性疾病。目前为止，已知的STGD3致病基因为极长链脂肪酸延长酶4基因(ELOVL4)。ELOVL4是位于内质网上的一种调节极长链饱和及多不饱和脂肪酸生物合成的限速缩合反应中不可或缺的膜蛋白。作为一种遗传性疾病，STGD3目前仍无有效治疗方法。然而，饮食补充极长链多不饱和脂肪酸可能是治疗STGD3的一种可行疗法。对STGD3基因及致病机制的研究可能将有助于发现STGD3的有效治疗方法及进一步了解其他遗传性视网膜变性疾病和更复杂的年龄相关性黄斑变性。(中国眼耳鼻喉科杂志，2015，15：441-444)

Stargardt病(STGD)是一种遗传性黄斑变性疾病，常于6～20岁起病，表现为双眼渐进性的中心视力下降、黄斑萎缩性变化、眼底黄色斑点和暗脉络膜荧光等。根据临床表现及致病基因的不同，该病曾被分为STGD1、STGD2、STGD3及STGD4 4种亚型。后研究发现STGD2的致病基因与STGD3相同，故目前已取消STGD2。其中，STGD1呈常染色体隐性遗传，为STGD的主要亚型，致病基因为位于染色体1p21-p22.1的视网膜特异性ATP结合转运基因(adenosine triphosphate-binding cassette transporter gene，ABCA4)，曾被称为ABCR[1-2]。STGD3及STGD4则呈常染色体显性遗传。STGD3的致病基因为位于染色体6q14的极长链脂肪酸延长酶4基因(elongation of very long chain fatty acid elongase 4，ELOVL4)[3-4]。STGD4的致病基因位于染色体4q，但致病基因仍不明确。除此之外，有报道[5-6]称少数STGD或“STGD-like”表型病也伴有CRB1，PROM1,RDS/PRPH2, VMD2 (BEST1)等基因变异。由于这些病例报道依然较少，其致病机制及存在于哪一类或几类STGD亚型尚不明确，因此本文不再详述。

由于STGD3是一种对患者视功能造成严重影响的遗传性黄斑变性疾病，且目前该病的遗传学病因及致病机制仍不明确，对STGD3的遗传学和致病机制的进一步研究可能有助于发现该病的有效治疗方法，和增强对其他遗传性视网膜变性疾病进一步了解，故对STGD3的基因研究进展进行综述。

1 STGD3的临床表现

STGD3由Klien和Krill于1967年首先报道[7]。STGD3表现为双眼渐进性的中心视力下降、黄斑萎缩性变化、伴或不伴眼底黄色斑点和无暗脉络膜荧光等。STGD常起病于6～20岁，但本病起病年龄范围较广，6～70岁均可起病[5,8-10]。中心视力损害常先于视网膜改变出现。随后双眼眼底出现黄斑萎缩性改变，伴或不伴黄色斑点。患者的眼底改变会随年龄增长而逐渐进展，中心视力也将渐进性下降。STGD3在脉络膜荧光血管造影检查中，常无暗脉络膜荧光表现，这是STGD3区别于STGD1的特征表现[8,11]。STGD3患者老年时视力常低于20/200，色觉轻度受损或与视力改变一致，ERG常无变化或轻度下降[8,10]。然而，STGD3患者的临床表现可有广泛变异，并无一个绝对的临床表现模式[11]。由于STGD3临床表现的多变性及与其他显性遗传视网膜疾病的相似性，如视锥视杆营养不良、中心性脉络膜萎缩及视网膜色素变性的某些亚型，导致较难将STGD3和这些疾病相鉴别[10]。

2 STGD3的基因研究

Stone等[8]于1994年在一个庞大的STGD3家系中进行了连锁分析，并将致病基因定位于6号染色体长臂位于标记D6S313和D6S252之间的18cM区域。在同一年，Zhang等[12]对一个来自美国印第安纳州的庞大常染色体显性遗传STGD家系进行了研究，发现染色体13q34上位于D13S159和D13S174之间的8cM区域可能和该病相关，并且把该病命名为STGD2。然而，在2001，Zhang等[3]又对这个家系中起初因年龄太小而不能明确诊断的孩子做进一步的研究，基因连锁及单倍体分析显示，该家系的致病基因位点为STGD3的6q14，从而消除了先前提出的STGD2亚型及其致病位点13q34。并且，STGD2也已从OMIM数据库及RetNet数据库(www.sph.uth.tmc.edu/Retnet)中消除[10]。2000年，Griesinger等[9]在一个表型与STGD3相似的常染色体显性遗传性黄斑营养不良的家系中进行单倍型分析，将致病基因定位于染色体6q14上的一个8cM区域，该区域位于STGD3的18cM范围内。

3 ELOVL4基因致病机制研究

2001年，Zhang等通过定位候选基因法，在患有STGD3或常染色体显性遗传性黄斑营养不良的5个相关家系中的所有患者中，发现了ELOVL4基因6号外显子内的5bp缺失(790-794 del AACTT)。这是首次发现ELOVL4基因——新的视网膜感光细胞特异性基因，并提示它所介导的脂肪酸生物合成参与了遗传性黄斑变性的发生。这个缺失导致了移码突变，导致了在C末端包括双赖氨酸定位信号在内的51个氨基酸片段的缺失，并导致从氨基酸264～271合成异常的肽链，之后是一个提前出现的终止密码子[3]。随后，Edwards等[4]在一个庞大的家系中证实了这一突变。同一年，Strom等在一个美国犹他州患有STGD3相似表型疾病的独立家系中，发现了ELOVL4基因6号外显子中的一种两个相隔4 bp的1 bp缺失(789ΔT + 794ΔT)复杂突变。该突变导致了移码突变，ELOVL4蛋白被截断，造成与先前发现的5 bp缺失相似的后果[5]。2004年，Maugeri等在一个有STGD3疾病特征的不相关欧洲家系中，发现了位于ELOVL4基因6号外显子中一个新的810C→G(Y270X)突变。这个突变导致270酪氨酸变成了终止密码子(Y270X)，蛋白截断及最后45个氨基酸的丢失。此外，他们进行了转染研究，发现与野生型ELOVL4不同，突变蛋白不定位于内质网，而以聚合物的形式出现在细胞质中[6]。3个已知的突变都位于ELOVL4基因相似的位置，都导致内质网滞留所需的双赖氨酸结构域的遗传信息缺失,即缺陷ELOVL4蛋白在C末端被截断，导致缺陷蛋白错误定位和聚集。

人类ELOVL4基因是一个具有6个外显子的32.7 kb基因。ELOVL4 cDNA的完整测序表明，ELOVL4基因编码一个314个氨基酸的蛋白酶，约35%的氨基酸与在酵母中参与脂肪酸链延伸的脂肪酸延长酶(elongase of fatty acids，ELO)家族成员同源[3,13]。ELOVL4是一种膜内在蛋白，拥有所有ELO家族成员的3个特征：预测的5个跨膜片段、C末端的双赖氨酸内质网滞留信号(KXKXX)、一个单一的二氧化铁结合结构域(HXXHH)[14]。ELOVL4蛋白酶定位于内质网，在内质网上介导极长链(≥C28)饱和及多不饱和脂肪酸生物合成的限速缩合反应[15]。ELOVL4是新发现的一种在维持视网膜感光细胞活性方面发挥重要作用的特异性蛋白酶。目前研究[16]已证实，ELOVL4这3个已知的突变均可导致视网膜黄斑部退化变性，中心视力下降，视物色暗、变形，最终可致盲。ELOVL4突变发生在保守的组氨酸结构域下游，保留了活性位点，但形成了被截断的且错误定位到高尔基复合体或在培养细胞中形成聚合物的蛋白，不能发挥生物活性[17-19]。同样，突变型ELOVL4也并不会影响野生型ELOVL4的生物活性[20]。

因此，在STGD3患者中光感受器细胞的死亡，可能是通过3种通路：①极长链多不饱和脂肪酸减少可能影响感光细胞的结构和功能；②截短蛋白的错误分布对细胞产生压力；③截短蛋白保留活性中心的酶活性产生有毒产物(3-酮中间体)[21]。截短ELOVL4蛋白有毒酮中间体的生产和蓄积导致极长链多不饱和脂肪酸的合成进一步减少。Logan等[22]在最近的研究中发现，即使截断蛋白保留了活性中心，错误定位的STGD3截断蛋白缺乏内在酶活性。他们发现，将截短蛋白重新定位到内质网上也无法恢复其功能。因此，由于基因突变导致的结构修饰致使STGD3蛋白质失去活性。此外，他们还发现，虽然在培养细胞中有与截短蛋白表达相关的形态学明显改变，但它并没有上调内质网应激通路。在培养细胞中，过表达的标记STGD3突变对野生型ELOVL4的定位表现出显性负效应[6,16-18,23]。截短突变蛋白能抑制野生型ELOVL4合成极长链多不饱和脂肪酸。当突变蛋白被重新定位到内质网上时，这种抑制作用加强。他们使用无细胞微粒体测定法进一步证明，截短蛋白即缺乏内在活性又抑制野生型ELOVL4的缩合活性，从而发挥显性负效应[20]。此外，虽然ELOVL4主要存在于视网膜，但并非仅限于此，其mRNA在皮肤、大脑和睾丸同样有高表达[24]。

4 ELOVL4基因突变STGD3的动物模型

由于小鼠和人类基因组间具有90%的相似性，且小鼠生命周期短(约2年)、费用便宜，目前最广泛应用的STGD3动物模型仍是小鼠模型。然而，小鼠模型的缺点是，视网膜上没有黄斑。但是，人们也越来越多地认识到黄斑疾病不仅影响黄斑区，而会影响整个视网膜，也有很多已知的人类黄斑疾病基因或突变嵌入小鼠后，导致小鼠视网膜疾病的证据[25-26]。

STGD3是一种常染色体显性遗传性疾病。单倍剂量不足及显性负效应是显性基因突变致病的2种典型途径。单倍剂量不足是指一个基因的正常单拷贝不能产生足够蛋白质来表现出野生表型。显性负效应是指突变基因产物对野生型产物的抑制作用，导致了功能基因产物减少。为了明确STGD3的机制，一些小鼠模型已根据视网膜表型被制作并评估。这些小鼠模型可分为3类：①ELOVL4基因缺失的基因敲除小鼠模型；②添加ELOVL4基因的转基因小鼠模型；③ELOVL4基因替换的敲入小鼠模型。3组小鼠模型中，带有纯合ELOVL4突变基因型的小鼠都由于皮肤屏障功能受损而发生新生儿致死[27]。因此，以下所有研究的小鼠模型都是杂合子。在基因敲除小鼠模型中，通过针对性地删除ELOVL4基因的2号外显子产生了两个ELOVL4基因敲除小鼠模型(KO1和KO2)，导致了敲除ELOVL4基因不能表达ELOVL4蛋白，来确定是否由于单倍剂量不足致病[28-30]。2种模型中，杂合基因敲除小鼠和野生型小鼠对比，只有细微的视网膜形态和超微结构差别，提示单倍剂量不足不是导致STGD3的分子机制。在转基因小鼠模型中，许多通过基因添加或基因替代方法制作的小鼠模型被用于检测是否是由显性负效应导致了STGD3。3种不同的转基因动物株系，转基因株系(transgenic line)1、2、3(TG1、TG2、TG3)，是通过整合人类的ELOVL4基因5 bp缺失突变而产生的，表现出渐进性视网膜变性和RPE脂褐素累积[18]。感光细胞的变性程度和ELOVL4突变转基因的表达成正比。在敲入小鼠模型中，ELOVL4基因5 bp缺失突变被引入小鼠的同源ELOVL4基因单拷贝中的2种敲入小鼠模型是分别由Vasireddy等[31](KI小鼠系)和McMahon等[32](KI+ 2小鼠系，在5 bp缺失突变的下游有另外2个点突变，这样这个区域的序列就和人类STGD3基因的DNA序列一致了)独立制作的。人类STGD3的表现在KI和KI + 2小鼠系中而被重现，除5 bp缺失基因敲入小鼠模型以外，还有第3个通过引入Y270X缺失突变产生的模型。然而，Y270X模型的视网膜表型尚未见报道。总之，在转基因和基因敲除小鼠模型中，已知的5bp STGD3等位基因的引入，导致了显性负效应，而ELOVL4单倍剂量不足则不是STGD3的致病机制。由于小鼠视网膜无黄斑，小鼠模型并不是人类STGD3很好的模型。猪的视网膜感光细胞的分布与人类视网膜更相似，它包括视锥细胞丰富区，如黄斑中央区。近年来，Sommer等[33]制作了4个Y270X猪系和一个5bp缺失转基因猪模型来更好地模拟STGD3的病理学改变。

5 未来研究方向

目前为止，尚无STGD3的有效治疗方法。然而，由于假定的ELOVL4功能，已有许多研究被设计来确定摄入脂肪酸对STGD3的疗效。在补充DHA用于治疗STGD3的动物模型中，结果也是不一致的[34-35]。也有关于人的脂肪及红细胞脂质与由ELOVL4突变引起STGD3严重程度的相关性研究。这些结果表明， STGD3家系的表型多样性可能与饮食中脂肪摄入量的差异有关，脂肪摄入量差异可通过脂肪和红细胞脂质反映[36]。在另一项研究中，1例15岁的STGD3患者补充了2个月DHA后，通过主观的调查问卷和客观的多焦视网膜电图(mfERG)检查均表现出视功能改善[35]。因此，膳食补充极长链多不饱和脂肪酸可能是STGD3的一种可行疗法。膳食补充治疗结合由核酶或RNAi介导的对缺陷基因产物的基因敲低疗法，通过解除显性负效应以及改变感光细胞的结构和功能，可能使患者进一步受益。对STGD3的遗传学和致病机制的进一步研究，可能有助于发现该病的有效疗法，和增强对其他遗传性视网膜变性疾病及更复杂的年龄相关性黄斑变性的进一步了解。

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(本文编辑 诸静英)

试题8.答案：B。梅毒患者瞳孔的经典表现是阿罗瞳孔(Argyll Robertson瞳孔)。在早期神经梅毒可见，但在晚期更常见。瞳孔大小不规则，极度缩小，近光反应分离，近光反应分离在正常大小的瞳孔更常见。阿罗瞳孔的瞳孔缩小，不应与Homer综合征的小瞳孔相混淆，前者可能伴有神经性梅毒,常与Roeder综合征有相同的临床特点。尽管类阿罗瞳孔更常见于神经性梅毒，但在多发性硬化、糖尿病、酒精中毒、大脑炎也可见。鉴别它们最主要的特点是瞳孔大小，神经性梅毒以极小瞳孔为其特点。刘家琦，李凤鸣. 实用眼科学. 3版. 人民卫生出版社，2014：625-627。

试题9.答案：D。弱视是一种单眼或双眼(双眼较少)最佳矫正视力低于正常，而未能发现与该视力减退相对应的眼球器质性改变。分为斜视性弱视、屈光参差性弱视、屈光不正性弱视、形觉剥夺性弱视。视网膜病变的视力下降是器质性改变引起的，不属于弱视。刘家琦，李凤鸣. 实用眼科学. 3版. 人民卫生出版社，2014：595-598。

试题10.答案：B。CNV又称视网膜下新生血管，可能的原因有变性疾病：老年黄斑变性、视盘玻璃膜疣和眼底血管样条纹症等；遗传性黄斑变性： Best病、Stargardt病、黄色斑点视网膜变性等；炎症性疾病：弓形体虫病、匍行性脉络膜炎、风疹性视网膜病变、结节病等；肿瘤；损伤：脉络膜破裂、氩激光治疗或视网膜冷凝损伤后的晚期并发症等。葛坚，等. 眼科学. 2版. 人民卫生出版社，2011：289-290。

浙江省自然科学基金(LY12H12001)；宁波市社会民生科技重大项目(2014C50091)；宁波市鄞州区科技项目(鄞科2013-90)

宁波大学医学院附属鄞州医院(鄞州人民医院)眼科中心 宁波 315041；＊香港理工大学眼科学院和医疗科技及资讯学系 九龙 999077通讯作者：陆勤康(Email: luqinkang@163.com; ranyonglanA9@gmail.com)

10.14166/j.issn.1671-2420.2015.06.021

2015-04-07)