单细胞凝胶电泳检测H2O2胁迫对蚯蚓体腔细胞DNA的损伤作用

王凤琴，张来军，李 聃

(1.陇东学院 生命科学与技术学院，甘肃 庆阳745000；2.海南热带海洋学院 水产与生命学院，海南 三亚 572022)

0 引言

蚯蚓是土壤中生物量最大的无脊椎动物，能够分解转化土壤中的有机物质，改善土壤的结构，富集重金属、杀虫剂等各种污染物。现已被广泛用于土壤环境的指示生物，进行土壤污染研究和监测工作。通过观察蚯蚓行为，皮肤、细胞和组织解剖学结构，检测蚯蚓的生理生化反应相关酶类的变化，全面了解和诊断土壤重金属污染和各种有机污染[1-3]；通过研究蚯蚓肠道中的微生物群落组成，探知蚯蚓对某些污染物的富集和转化，促进土壤污染的修复[4]。蚯蚓细胞DNA损伤也是检测污染物致癌、致畸、致突变效应的理想生物标志物，用于土壤污染遗传毒性分析和环境风险预测[5-6]。由于人工饲养蚯蚓的方法简便，甚至可以进行无菌培养[7]，体腔细胞分离便捷，分离的细胞数量多且纯净，可以开发用于更广泛的研究用途。

单细胞凝胶电泳技术是检测有核细胞DNA损伤最常用的方法之一，试验周期短、样品用量少、结果灵敏、快速高效，广泛应用于新药开发、遗传毒性检测以及农药等环境安全检测。将蚯蚓体腔细胞与单细胞凝胶电泳技术结合进行的各种细胞毒理实验也多有报道[8-9]。本实验通过单细胞凝胶电泳技术分析过氧化氢对蚯蚓离体体腔细胞DNA损伤的影响，寻找两者之间的相关性，为将蚯蚓替代其他实验动物以初步筛选具有抗氧化功能、对细胞有保护作用的天然抗氧化剂的研究提供参考。

1材料和方法

1.1实验材料与仪器

赤子爱胜蚓(Eiseniafetida)由河北省石家庄市晋州市蚯蚓养殖场提供，且在室内饲养4周以上。H2O2为西安化学试剂厂分析纯试剂；低熔点琼脂糖(LMA)、正常熔点琼脂糖(NMA，西班牙)、Triton X-100、肌氨酸钠、二甲基亚砜(DMSO)均为Amresco分装产品；愈疮木酚甘油醚(Guaiacol Glyceryl Ether)及其余试剂均为国产分析纯。倒置荧光显微镜(德国Leica 公司DMI3000)、电泳仪(Tanon EPS 300)、电泳槽(北京六一生物技术有限公司，DYCP-33A)。

1.2 实验方法

1.2.1 蚯蚓体腔细胞的分离提取

挑选体质量为400～500 mg、体长约6～7 cm，最好是还未长出生殖带的健康蚯蚓进行实验。将蚯蚓在25 ℃，湿度65%，暗环境下清肠24 h。经过预实验，H2O2浓度梯度设置为0、60、120、240、480 μmol·L-15个梯度。

根据Eyambe的方法[10]提取蚯蚓体腔细胞，略有改动。选2～3条蚯蚓，避开生殖带，剪取体后部约三分之一长的躯干放入离心管，加入400 μL预冷的体腔细胞提取液(EM:5% C2H5OH，95% 生理盐水，10 mg·mL-1Guaiacol glyceryl ether，2.5 mg·mL-1Na2EDTA，pH 7.3)；1 min后，加入3倍体积预冷的PBS缓冲液，弃蚯蚓，1 000 r·min-1低速离心3 min，冲洗体腔细胞，再加入适量预冷的LBSS缓冲液(75.5 mmol·L-1NaCl，4.8 mmol·L-1KCl，1.1 mmol·L-1MgSO4·7H2O，0.4 mmol·L-1KH2PO4，0.3 mmol·L-1Na2HPO4，4.2 mmol·L-1NaHCO3,pH 7.4)。显微镜下观察细胞活力，瑞氏姬姆萨染液染色后观察细胞形态。将细胞悬液混匀后平均分为5份，分别加入不同浓度的H2O2，室温(25 ℃)胁迫60 min，胁迫结束后，离心收集细胞，重新悬浮于PBS溶液中，调整细胞密度，准备电泳。

1.2.2单细胞凝胶电泳

按Zhang等[11]改良方法铺胶，将细胞悬液和1%低熔点胶1∶1混合均匀，铺在预处理后的载玻片上。琼脂糖凝固后，按常规单细胞凝胶电泳方法进行操作，从裂解、变性解旋、电泳以及中和的所有过程需在4 ℃下进行。EB染色20 min后，将载玻片置于荧光显微镜下观察拍照，每个处理组随机取约50个细胞的图片。

对获得的各处理组的彗星图片经CASP图像分析软件分析后，得到多项表示DNA损伤程度的参数。本实验选用尾部DNA含量(TDNA%)、尾长(TailLength，TL)、尾矩(从彗星头的右边界到彗星尾部末端的距离与尾部 DNA 含量的乘积，TailMoment，TM)和Olive尾矩(从头光密度重心到尾光密度重心的距离与尾部 DNA 含量的乘积，Olive TailMoment，TOM)4项作为本实验衡量细胞DNA损伤程度的评价指标。

以上实验重复3次。

1.3数据处理

用SPSS 13.0软件进行统计检验，单因素方差分析(ANOVA)进行组间差异分析，采用LSD(方差齐性)或 Dunnett (方差不齐)进行多重比较，将H2O2各浓度处理组与对照组之间进行差异显著性分析，显著性以 3 个水平表示，分别为P<0.05、P<0.01 和P<0.001。绘图在 Excel中完成，数据以均值±标准差来表示。

2结果与分析

2.1蚯蚓的体腔细胞

蚯蚓体腔细胞在细胞免疫中发挥着重要的作用，其细胞免疫功能主要是通过体腔细胞执行。所提取的蚯蚓体腔细胞悬浮液由于其中大量黄细胞的存在而呈淡黄色。镜下观察，可看到大量大小、形状各不相同的细胞存在于悬浮液中，如图1(a)所示。用甲醇固定细胞后，瑞氏姬姆萨染液染色，细胞质被染成粉紫色，细胞核被染成深紫色，如图1(b)所示。其中黄细胞(A)数量居多，个体最大，核质比小，紫色核居中或偏于细胞一侧，这类细胞胞质中会积累核黄素和外来物质，比其他体腔细胞对污染物更为敏感[12]；嗜中性细胞(B)个体较大，细胞核也较大，呈紫色；嗜碱性细胞(C)个体较小，数量较多，染色质致密，核深紫色，核质比小。

A黄细胞;B嗜中性细胞;C嗜碱性细胞(a) 未染色蚯蚓体腔细胞 (b) 瑞氏姬姆萨染液染色图1 蚯蚓体腔细胞(400×)

2.2 单细胞凝胶电泳

典型的蚯蚓体腔细胞单细胞凝胶电泳图如图2所示。

(a)H2O2浓度为60 μmol·L-1 (b)H2O2浓度为240 μmol·L-1图2 典型的蚯蚓体腔细胞单细胞凝胶电泳图(400×)

从图2可知，由于H2O2的作用，细胞核中 DNA 断裂，在碱性电泳缓冲液作用下，DNA超螺旋结构松散，断裂的 DNA 碎片从超螺旋结构中释放出来，在电泳时移向阳极。荧光染色后，在显微镜下观察到尾部朝向阳极的彗星样图像。彗星头部和尾部的荧光强度、彗星全长及慧尾的长度等特征均能够反映核DNA损伤的程度，或与H2O2胁迫的浓度相关。

用CASP软件处理后，不同浓度H2O2各处理组彼此之间DNA损伤结果如图3所示。用不同浓度H2O2胁迫蚯蚓体腔细胞1 h，进行单细胞凝胶电泳，CASP软件处理后得到TDNA%、TL、TM和TOM4项参数值，与0、60、120、240和480 μmol ·L-1的H2O2浓度相对应的TDNA%分别为17.00±11.58、18.51±10.09、23.70±10.30、27.64±12.38和30.91±9.09；TL分别为24.85±9.73、28.46±8.46、30.00±7.13、31.71±7.65和34.12±3.78；TM分别为5.25±4.87、6.04±4.75、7.78±5.03、9.59±6.02和10.83±4.11；TOM分别为4.78±3.53、5.43±3.33、6.73±3.54、8.12±4.05和9.24±2.85。从图3可以看出TDNA%、TL、TM、TOM值均随H2O2浓度升高而提高。与对照组比较，除了最低浓度组60 μmol·L-1外，其他各处理组的TDNA%、TL、TM和TOM值都具有显著差异(P<0.05)，且H2O2浓度越高，差异越显著。最高浓度480 μmol·L-1的TDNA%比对照组提高了1.8倍(P<0.001)，TL提高了1.4倍(P<0.001)，TM提高了2.1倍(P<0.001)，TOM提高了1.9倍(P<0.001)。4组H2O2处理组组间的4项参数值差异随浓度升高也均达到显著水平(P<0.05)。实验揭示，H2O2胁迫蚯蚓的离体体腔细胞1 h后，细胞DNA产生了明显的损伤，H2O2浓度越高，损伤越严重；H2O2浓度与蚯蚓体腔细胞DNA损伤程度两者之间呈显著的剂量-效应关系。

注：*、**、***分别表示与空白对照相比，达到P<0.05、P<0.01、P<0.001显著水平。图3 不同浓度H2O2胁迫下蚯蚓体腔细胞单细胞凝胶电泳结果

图3也表明，在本实验条件下，表示细胞DNA损伤的4个参数TDNA%、TL、TM、TOM变化较为一致，均能很好地反映出H2O2浓度与细胞DNA损伤程度之间的相关性。

3 讨论

蚯蚓是土壤中生物量最大的无脊椎动物，对环境污染物表现出极强的耐性和抗性，是生态毒理学和土壤污染研究理想的实验材料。实验室人工饲养蚯蚓方法简便，还可以无菌培养，这些优势使蚯蚓作为实验动物开发并用于更广泛的研究创造了条件。李红玉等[13]以秀丽线虫为实验材料，尝试开发抗氧化药物筛选试剂盒，他认为秀丽隐杆线虫培养条件简单，世代周期短，寿命短，容易实现高通量的优势，是体内抗氧化药物高通量筛选的理想模型。尽管蚯蚓也几乎具有以上所有优点，但极少有人做这方面的尝试。

由于生物机体内的H2O2通过生成OH自由基(·OH)，对细胞造成损害，抗氧化剂能清除外来或内源性生成的活性氧(ROS)，拮抗DNA损伤，保护生物体完整性[14]。天然来源的抗氧化剂绿色环保，安全性高，用途广泛[15-17]。对天然抗氧化剂的抗氧化活性的测试有很多方法，其中H2O2构建的细胞损伤模型，常常用于对细胞具有保护作用的抗氧化剂的研究[18-19]。本研究将提取出的蚯蚓体腔细胞，用不同浓度的H2O2处理，结合单细胞凝胶电泳技术检测体腔细胞DNA损伤程度，揭示H2O2与蚯蚓体腔细胞损伤之间的相关性，为探索能拮抗自由基，保护细胞免受DNA损伤的天然抗氧化剂的初步筛选提供新思路，这种方法节省成本，高效，经济。单细胞凝胶电泳实验结果揭示了随H2O2浓度升高，代表DNA损伤程度的4个参数值TDNA%、TL、TM、TOM也随之升高，H2O2浓度与蚯蚓体腔细胞DNA损伤程度两者之间呈显著的剂量-效应关系，可以进一步考虑将蚯蚓体腔细胞用于天然来源抗氧化剂抗氧化活性的研究。